磷酸激酶RIOK2是APC_C复合物中的新成员.pdfVIP

．iL—J一 月IJ蟊 研究背景 (1)细胞周期及其调控。细胞周期也称“细胞分裂周期”，是指一个细胞经 生长、分裂而增殖成两个子细胞所经历的全过程，通常可分为若干阶段，即G。 期、S期、G。期和M期。细胞在G．期完成必要的生长和物质准备，在S期完成染 色体DNA的复制，在G：期进行必要的检查及修复以保证DNA复制的准确性，然 后在M期完成遗传物质到子细胞中的均等分配，并使细胞一分为二。真核细胞内 有一个调控机构，使细胞周期能有条不紊地依次进行，组成这个机构的关键蛋白 和B分别在S期，G：期和有丝分裂早期起作用，周期蛋白D和E在G。期表达。 Cyclins周期性出现和消失是细胞周期正常运行的I；{『提。研究表明许多调控细胞 周期的蛋白程序性降解由泛素蛋白酶体系统执行，即泛素、泛素激活酶(E1)、泛 素结合酶(E2)、泛素连接酶(E3)、26S蛋白酶体、泛素再循环酶等。 (2)泛素一蛋白酶体途径(ubiquitin—proteasomepathway，UPP)。细胞 周期蛋白被泛素化后为蛋白酶体所识别，被泛素化的蛋白就会被降解。通过泛素 一蛋白酶体途径(ubiquitin—proteasomepathway，UPP)降解蛋白包含两个连 续的步骤，一、将泛素链共价连接到底物分子上，二、通过26S蛋白酶体降解蛋 白并释放出可重新利用的泛素分子。详细过程是，首先，泛素激活酶E1通过一 个消耗ATP的反应产生一个高能量的硫羟酸酯中间体(thiolester 酶的底物上。一。通过不断的将泛素连接到赖氨酸残基上，形成了一个泛素链， 从而被下游的26S蛋白酶体识别。E3在UPP途径特异性识别上发挥了重要作用。 E3是UPP中最重要的成分，它决定泛素化反应中底物的特异性、招募相应的E2 并影响它的活性“1。 (3)APC／C复合物。APC／C(anaphasepromoting 细胞周期后期促进复合物是由多个亚基组成的1．5MD的E3泛素连接酶，与细胞 的有丝分裂和减数分裂有着密切的关系o’71。APC／C复合物通过其核心亚基磷酸 化、激活和抑制因子的调节来实现在不同细胞周期的阶段其底物泛素化的特异 性。在M期，前中期纺锤体形成检验点(spindleassemblycheckpoint)蛋白 妹染色单体的着丝点还没有与微管结合的时候，纺锤体形成检验点阻止APC／c“” 的激活。在中期，当所有的着丝点都与微管结合后，细胞由中期向后期的转换， 纺锤体将染色单体拉开。这个过程中APc／C可能定位在着丝粒上或者染色体和纺 锤体上“。…。APC／C“”失活Cdkl，从而使Cdkl的底物去磷酸化从而结束有丝分 裂。 物中的作用明显，它既是APc／c功能复合物上的核心亚基，又是一个潜在的调节 作为Cdhl的底物被泛素化和降解的过程““。在脊椎动物中ApclO直接与APC RING—H2结构域，这两个结构域介导了这两种蛋白的结合“””’“。而Apcll上的 和Apc8都包含一个TPRmotif，介导蛋白复合物的结合，它们在有丝分裂期间 被磷酸化，从而激活APC／C“”1。 图1．APC／C在酵母细胞中中泛素化作用机制模型。 研究目的及方向 kinase 由于它与酵母RIO 2(RmK2)氨基酸序列高度同源，故得其名。生物信 息学分析显示，它全长552个氨基酸，含有三个功能结构域：WH结构域(卜90， helix winged domain)，激酶结构域(91—308，kinasedomain)，谷氨酸富集区 (309—430，Glu—rich 这些功能结构域提示，它的功能的发挥可能有赖于某些蛋白质的相互作用或磷酸 化某些底物蛋白质，并可能由胞质进入胞核。 人RIOK2是由国家人类基因组计划北方研究中心通过高通量筛选技术筛选 出的激酶中的一个。国内外相关的研究报道较少，只在乳腺癌感染的表达谱中发 现上调，是一个功能未知的新基因。在研究新基因时，我们的思路是：首先，通 过酵母双杂交和蛋白质相互作用实验研究新基因编码的蛋白与哪些蛋白相互作 用。然后，根据其相互作用的已知功能蛋白以及新基因编码蛋白结构域所以提示 的可能性预测其功能，并通过实验验证。前期实验中我们通过酵母双杂实验发现 免疫共沉淀实验验证了这一相互作用，并证明RIOK2通过激酶区与与ApclO／Docl 结合。我们构建了无激