DNA的琼脂糖凝胶电泳.pptxVIP

DNA的琼脂糖凝胶电泳;一、实验原理 ; DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中通过琼脂糖凝胶向阳极移动。 不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电泳条件下（如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等），有不同的迁移率，所以可通过电泳使其分离。;DNA在电场中的迁移率的影响因素;琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶（EB）染色。 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基之间，形成一种荧光络合物。在254nm波长紫外光照射下，呈现橙黄色的荧光。 用溴化乙啶检测DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。;琼脂糖凝胶电泳的优点;琼脂糖凝胶电泳的应用;二、试剂与器材;试 剂;5、DNA Marker ;1、水平板型电泳槽 2、直流稳压电泳仪 3、微量移液枪 4、凝胶成像系统：可发射紫外光，通过电脑进行凝胶图像的实时观测 ;三、操作方法 ;2、凝胶板的制备 置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。待琼脂糖冷至65℃左右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。静置0.5小时。; 待凝固完全后，用滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板，则在胶板上形成相互隔开的样品槽。将凝胶连同水平板放入电泳槽平台上。倒入TBE缓冲液直至浸没过凝胶面2-3mm。; 3、加样 将待测DNA样品液与5×Loading Buffer以4：1的体积比混合，用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。每个糟加10μL左右。 加样时，使样品集中沉于槽底部。 DNA Marker取5μL直接进行加样。 ;点样时应注意哪些问题？; 4、电泳 加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。 样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)。当溴酚蓝条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。 ;5、染?? 将电泳后的胶取出，小心推至溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。;6、观察与拍照 小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下进行观察。 DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。 ;四、实验结果;五、课后研讨题