山东大学研究生国家课程_基因克隆.pptVIP

 基因克隆 基因工程的基本过程 目的基因的获得 载体DNA及其改造 体外DNA重组 重组DNA的转化 重组子的筛选、鉴定与克隆扩增 目的DNA在受体细胞中的表达 基因工程过程示意图 概 述 基因克隆（Gene cloning）：是通过分子生物学技术获得一段基因或DNA片段的大量拷贝，从而对该基因进行研究或应用的过程和技术，又称为DNA克隆。 目的基因：基因克隆中所扩增的基因，又称为外源基因（foreign DNA）。 DNA重组：利用酶学的方法，在体外将不同来源的DNA进行特异性切割，并重新拼接，组合成一个新的杂合DNA分子的过程。 一、目的基因的获得 已知基因的获得 化学合成法 PCR扩增法 未知基因的获得 构建基因组文库利用鸟枪法克隆目的基因 构建cDNA文库，筛选目的基因 mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 I 已知基因的获得 化学合成法 DNA化学合成仪 多聚合酶链反应（PCR） DNA 体外扩增技术 Oligo DNA的人工化学合成是从1967年以后开始兴起的。随着科学技术的进步，DNA合成仪的完善，现在一般都采用固相亚磷酸三酯法，使用全自动DNA合成仪进行Oligo DNA的合成。Oligo DNA合成是由3→5进行合成的，一般3的第一个碱基结合在Glass担体（Controlled Pore Glass，CPG）上。 Oligo DNA合成原理图。N1代表第一个碱基，N2代表第二个碱基，依次类推。 2、PCR扩增法 II 未知基因的获得 1. 构建基因组文库，利用鸟枪法克隆目的DNA 基因组文库指某一生物基因组DNA的全部序列。 将完整基因组（genome）的随机片段克隆入某种载体的方法，用于建立基因库或筛选特定基因。 2. 构建cDNA文库，筛选目的基因 cDNA是指以mRNA为模板，在反转录酶的作用下形成的互补DNA（简称cDNA）。 cDNA文库（cDNA library）即包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆的集合 。 cDNA文库基本构建过程 提取组织细胞的全部mRNA，在体外反转录成cDNA，与适当的载体连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这些细菌的集合构成该组织细胞的cDNA文库。 3、mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 差异显示：是利用一对组织基因表达的差异，筛选出在某种组织中受某因素调控的一个或一组差异表达基因的常用方法。 mRNA差异显示：是筛选差异表达基因的最有效方法之一。mRNA差异显示又称为差异显示反转录PCR（differential display RT-PCR，DDRT-PCR） mRNA差异显示技术的基本原理和过程 1. 建立一组具有可比性的细胞（如肿瘤组织和正常组织），抽提其在某一条件下表达的所有mRNA，构建cDNA文库。 2. 同时以实验组（肿瘤细胞）和对照组（正常细胞）mRNA为模板，经RT-PCR制备放射性cDNA探针。 3. 分别与上述实验组cDNA文库进行杂交；然后用变性聚丙烯酰胺测序胶分析其差别，将有差别的基因克隆化，进一步分析其结构与功能。 4、差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 差异蛋白质谱表达技术是利用双向蛋白电泳对相关细胞中蛋白表达的差异进行比较、克隆，从而鉴定相关功能蛋白的方法。 能直接分析蛋白表达的差异，能够最大限度地减少假阳性率，提高工作效率，较mRNA差异显示技术更为简便有效，是功能基因组学研究中兴起的新技术。 双向蛋白电泳的原理 第一向基于蛋白质的等电点不同用等电聚焦分离，第二向则按分子量的不同用SDS分离，把复杂蛋白混合物中的蛋白质在二维平面上分开。近年来经过多方面改进已成为研究蛋白质组的最有使用价值的核心方法。 差异蛋白质谱表达技术的基本过程 建立具有可比性的细胞在某一条件下的表达质谱 抽提两种或两种以上的细胞中的蛋白，经双向蛋白凝胶电泳，将各种蛋白按相对分子量的大小和带电荷情况完全分开。 通过图像分析和软件处理，比较两种细胞中蛋白表达的差异。 切下差异表达的相应条带，通过氨基酸测序，获得新基因的部分序列，并据此合成探针，从相应文库中获取、克隆全基因。 二、载体DNA及其改造 1. 作为载体的条件 具备控制复制、转录的位点 有多种酶的单一酶切位点 存在易于检测的表型标志 分子量小，多拷贝 携带幅度宽 生物安全性好 3. 载体的分类 克隆载体：用于克隆扩增 pBR322 表达载体：用于复制、表达 pcDNA3, pVAX1 带有基因表达各种元件的载体,使携带的外源基因在宿主细胞中表达。 5. 质