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HIV病毒分子生物学检测技术最新进展 【摘要】随着艾滋病感染患者的增多，为适应艾 滋病大规模筛查和尽量早期诊断治疗的需要，目前艾滋病检 测技术向着简易、快速、可靠的方法的方向发展，HIV核酸 检测的灵敏度和特异性显著提高，缩短检出HIV的窗口期， 在艾滋病早期诊断和治疗以及艾滋病的预防方面发挥着重 要作用，是HIV实验室诊断发展的主要方向。本文对HIV核 酸检测的各种技术原理、特异性、可靠性及临床实用性的前 沿研究进展进行综述。 【关键词】HIV病毒；分子生物学检测；进展 艾滋病病毒(HIV)主要侵袭人体免疫系统，导致人体 免疫缺陷发生多种感染疾病或肿瘤。艾滋病的不可治愈及其 快速传播使患者不断增多,2012年全球感染总人数已达3900 万人，中国近半艾滋病病毒感染者尚未发现，为了防止艾滋 病的大规模流行，艾滋病的检测工作越发重要。目前筛查的 免疫学方法，由于灵敏度低，漏检窗口期和新近感染病毒的 感染者，而以核酸检测为代表的分子生物学技术，灵敏度和 特异性均显著提高，明显缩短检出病原体的窗口期，是HIV 诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向，对遏制艾滋病的 传播蔓延有重要意义。 1 HIV生物学特性 HIV呈圆形或椭圆形，直径900?140nm,外层为类脂包 膜，成分是外膜糖蛋白(gpl20)和跨膜糖蛋白(gp41),核 心由RNA逆转录酶、DNA多聚酶和结构蛋白等组成，基因组 除了具有逆转录病毒的基本结构一一基因长末端重复序列 (LTR)、核心蛋白(gag),聚合蛋白(pol)、包膜蛋白(env) gF,还有非常复杂的调控机制，包括tat、rev、nef、vif、 vpr. vpu等调节基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个 环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。HIV基因组中存在3 个gag-pol- env. Gag基因编码的核心蛋白均位于病毒的核 酸蛋白体上，P17位于核蛋白与壳层之间的基质上，包被于 包膜蛋白的内部。核衣壳包被于内部核酸的外围，由主要的 P24和P40及P55组成，其结构比较稳定，是HIV-1型的特 异性蛋白。Env编码包膜蛋白即gpl20和gp41,起协助HIV 进入宿主细胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31,它 位于病毒的核区内，并与病毒核酸紧密相关［1］。 根据env基因V3段碱基排列的不同，HIVT分为11个 亚型即 A、B. C、D、E、F、G、H、I、J、M 和 0 亚型，HIV-2 分为6个亚型［2］,不同国家和地区有相对优势亚型，HIV亚 型在流行病学、诊断、临床、试剂选择、药物筛选和疫苗研 制上有着重要意义。 2 HIV-1的感染机制及感染标志 病毒侵入人体后，通过病毒表面gp!20在化学因子CCR5 或CXCR4帮助下与细胞表面受体CD4分子结合，然后在gp41 的协助下HIV的膜与CD4+细胞的细胞膜相融合，病毒核心蛋 白及RNA进入胞浆。两条RNA+在逆转录酶作用下成DNA-, 在DNA多聚酶的作用下复制DNA,此DNA部分存留在胞浆内 产生系列变化，然后在细胞膜上装配成新病毒，再感染其它 细胞。HIV感染后，首先能够监测到病毒RNA,其次是p24 抗原，最后是抗体［3］。 3分子生物学检测技术 随着分子生物学检测技术快速发展，HIV RNA或DNA检 测得到应用，核酸检测已是艾滋病实验室诊断的主要发展方 向［4］,在HIV感染的监测、诊断、研究、疗效观察及预后 判断等方面均发挥着越来越大的作用，主要有定性和定量两 类。 3.2定性检测 3. 2. 1 原位杂交（insite hydzmion） 应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的 HIV病毒靶核酸，起初标记探针是放射性标记，后来逐渐发 展为酶标记或化学发光标记等等。原位杂交的阳性率比聚合 酶链反应（PCR）略低，随着核酸扩增技术的出现并广泛使 用，基因探针技术也就逐渐失去应用意义。 3. 2.2聚合酶链反应技术（PCR） PCR是一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技 术。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于 与靶序列两端互补的寡核昔酸引物。PCR由变性一退火一延 伸三个基本反应步骤构成。患者感染HIV 1?14d后血浆中 能检测出HIV RNA,可用于急性感染期患者、抗体检测不确 定等情况的辅助诊断或用于血液筛查，尤其在HIV阳性母亲 产下的婴儿是否感染HIV的诊断中有着非常重要的意义，前 病毒DNA PCR检测法对出生48h内的婴儿检测敏感性为38%, 出生14d的婴儿检测敏感性达93%[5] o 3.2. 3逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR） RT-PCR技术通过对RNA逆转录酶的应用实现，即将病毒 RNA逆转录DNA,接着进行PCR,指数扩增DNA片段，将放大 产物变性并与多孔板