水飞蓟素可增加斑马鱼对铜离子的耐受度.doc

斑馬魚第四型蛋白質去磷酸酶催化次單元與調控次單元之選殖與 活性分析 1蕭蓉禎、2劉婉琳、2溫育德 1建國科技大學美容系 2國立彰化師範大學生物學系 摘要： 第四型蛋白質去磷酸酶（Protein phosphatase 4: PP4）是屬於protein serine/threonine phosphatases（PPP）的成員之一，PP4是由一個催化次單元（catalytic subunit: PP4C）及數個調控次單元（regulatory subunits： PP4R1、PP4R2、PP4R3）所組成。目前對於PP4在人類細胞的功能所知甚詳，然而在水生生物的作用機制則尚未完全瞭解。本研究選殖斑馬魚（zebrafish）體內的PP4C及PP4R2的cDNA，並利用E. coli表現系統，大量表現PP4C及PP4R2，經由管柱純化後，進行酵素活性分析。實驗結果顯示利用E. coli表現的重組zebrafish PP4C會形成inclusion body，而重組 zebrafish PP4R2則以soluble form的型式存在。酵素活性分析的結果發現，重組zebrafish PP4C及zebrafish PP4R2並無顯著的去磷酸酶活性，進一步的利用6M urea讓zebrafish PP4C變性及以共同表現重組 zebrafish PP4C- PP4R2複合體，皆無法增加改善其去磷酸酶 關鍵字：第四型蛋白質去磷酸酶、催化次單元、調控次單元、斑馬魚 前言 1950年代，Fischer與Krebs在研究中發現，由激酶所調控的磷酸化反應可活化肝醣磷解酶的活性，證實酵素活性需藉由激酶（kinases）或去磷酸酶（phosphatases）來調節（Fischer, et al., 1955）。近年來的研究指出，人類有超過百分之三十的蛋白質會被磷酸化，這意味著，可逆性的磷酸化反應遍佈於細胞中（Johnson, et al., 2005）。蛋白質去磷酸酶，若依據其序列相似度、立體結構及對抑制劑的敏感性來區分，可分為三個不同的家族：dual specificity phosphatase，protein tyrosine phosphatase（PTP）及protein serine/threonine phosphatase（PPP/PPM）。PTP家族是會對tyrosine進行專一性作用；PPP/PPM家族是對serine/threonine有專一性；而dual specificity phosphatse家族則是對serine/threonine及tyrosine都具有專一性作用的去磷酸酶。雖然有些去磷酸酶屬於同一個家族，但在其結構上具有多樣性，而這樣的多樣性，取決於各磷酸酶其特殊的調節區與辨識區（Dombradi, et al., 2002）。 PPP這個家族，依據受質的選擇性、對抑制劑的敏感性及對二價陽離子的需要性，再分成PP1、PP2A、PP2B、PP3、PP4、PP5及PP7五種isoforms。在序列的比對上，此家族大約有百分之四十的相似度。PP4是由一個catalytic subunit（PP4c）及數個regulatory subunits（例如：PP4R1、PP4R2、PP4R3）所組成（Gingras, et al., 2005）。PP4是一種和PP2A相關的蛋白質去磷酸酶，其在胺基酸序列的比對上，PP4c與PP2Ac具有百分之六十五的相似度，不論是基質專一性或是抑制劑的研究上都顯示和PP2A相似，但PP4卻無法與PP2A的調節次單元相結合。目前的文獻指出，可從牛的睪丸中純化出PP4c（35-37kDa）及PP4R1（105 kDa）；另外，也從哺乳動物的骨骼肌及睪丸中純化到PP4c及PP4R2（50 kDa），發現PP4R2會與PP4c結合作用到中心體的位置，被視為參與微管（microtubles）的形成。在酵素活性方面，發現加入二價金屬離子（如：Co2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+），並不會改變去磷酸酶活性；至於詳細PP4的生理功能及其作用機制目前尚未完全瞭解。 目前已知關於PP4的研究，大多是利用活體萃取得到可溶性蛋白（Reed, et al., 2003），雖然此種方式可偵測出少量的去磷酸酶活性，但因哺乳類動物的蛋白質產率較低、成本也較高，導致在研究上受到各種的限制，因此，本實驗利用E. coli表現系統來大量表現並純化具有活性的recombinant PP4c，目的是希望藉由此重組蛋白更深入去研究探討PP4c的結構、功能及其作用機制，並進一步尋找到PP4的專一性受質。 材料與方法 選殖zebrafish PP4C、zebrafish PP4R2 根據NCBI（National Center for