细胞冻存.docVIP

（一）细胞冻存　　1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液；　　2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管中、；　　3. 离心1000rpm，5min；　　4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入适量配制好的冻存培养液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，计数，调节冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml；　　5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml；　　6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；　　7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/?　　min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。　　（二） 细胞复苏　　1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入 3.3?三、注意事项 　　1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；　　2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；　　3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。 细胞冻存操作步骤与细胞复苏 细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。细胞冻存操作步骤： 细胞1、选用生长情况好，数量较多的原代细胞，冻存前一天换液一次。 细胞2、贴壁细胞需用0.25％胰酶常规消化将细胞消化下来，将细胞悬液收集至离心管中。 细胞3、1000rpm离心5分钟，弃上清液。 细胞4、沉淀加含DMSO的培养液，计数，调整至(1-10)times;106/ml。 细胞5、将悬液分至冻存管中，每管1 ml。 细胞6、密封冻存管，封口一定要严，否则复苏时易出现爆裂。 细胞7、用记号笔标明细胞种类，冻存日期。 细胞8、按下列顺序降温：室温rarr;4℃(20分钟〕rarr;冰箱冷冻室(30分钟)rarr;超低温冰箱(－80 细胞的复苏 一、细胞复苏的原则 在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。 二、细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃ (3)在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃ 三、注意事项 在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段(-5～0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上(已死亡)的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。 siRNA反向转染法提高原代悬浮细胞转染效率的应用 【关键词】? 小干扰RNA； 反向转染法； 正向转染法； 原代细胞； 悬浮细胞 　　RNA干扰（RNA interference, RNAi)是指小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)进入细胞后，按照碱基互补配对原则与靶mRNA完全互补配对，进而引发靶mRNA的降解、抑制靶基因的表达。RNAi因其对靶基因的沉默具有高度的特异性和强大的抑制作用正越来越多地被应用于多种疾病的预防和治疗研究［1］。siRNA必须进入细胞内才能发挥对基因的沉默作用［2］，因此，如何将外源性siRNA高效地转入靶细胞就成为基因抑制成功与否的关键。????　　基因转染的方法很多,如磷酸钙沉淀法、电穿孔、脂质体法、显微注射法、逆转录病毒法等。????　　逆转录病毒是目前效率最高的转染载体，但由于其价格昂贵，构建耗时而不作为实验的首选。阳离子脂质体法是较方便的转染方法之一［ 3］，在各种体外培养细胞的RNA干扰实验中,多以阳离子脂质体进行转染，但其对于原代悬浮细胞仍存在转染效率低的问题，故本实验在脂质体的介导下，运用反向转染法［4］和传统正向转染法转染小鼠脾淋巴细胞，比较两种方法的转染效率，寻找对原代悬浮细胞更高效的基因转染方法。????　　1? 材料与方法????　　1.1? 实验材料??????　　8～10周清洁级 BALB/c 雌性小鼠（扬州大学比较学院实验动物中心），小鼠淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品科技有限公司），RPMI1640培养基，Opt