单细胞培养课程教学课件.pptxVIP

Haberlandt：; ; 第5章 单细胞培养及突变体筛选 1 细胞培养 2 单细胞的分离 3 单细胞的培养方法 4 突变体的筛选;1 细胞培养 1.1 细胞培养：将植物体或其培养物游离的细胞或小细胞团进行培养的方法。 培养方式 单细胞培养 悬浮细胞培养 培养对象 细胞个体 细胞群体 培养产物 单细胞克隆系 次生代谢产物 酶制剂、人工种子等 应用领域 筛选突变体， 食品、药品、工业原料、 细胞学研究， 农业生产 进行遗传操作 ;1.2细胞培养的意义：; 2 单细胞的分离; 2.1 由外植体直接分离 ⑴物理法： 叶片→捣碎→过滤、离心→收集细胞 ⑵酶解法：;2.2 由愈伤组织获得 ; 要求：???散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。 适于悬浮培养 适于再生植株;将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物;;2、单细胞培养方法：;2.1 培养方法： 1）平板法（plating culture） （薄层培养）1960年Bergamann首创，是在固体培养基中培养单细胞的一种方法。 ;;I 细胞密度：指单位体积内的细胞数量，是影响细胞培养的关键因子。 平板培养要求保证细胞密度为10 4 -10 5 个/ml 。 II平板培养的效果用植板率来衡量。 ; ;2）看护培养;;优点：简便、成功率高 缺点：不能在显微镜下直接观察;3）饲养培养（feeder layer culture）： 原理：平板法＋看护法 评价：单细胞和原生质体培养的理想方法。注：饲养层细胞没有种属特异性。;4）微室培养（microchamberculture) 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称为微室培养法。此法首先是由Jones等（1960）设计;;优点：可对细胞培养过程连续进行显微观察，了解一个细胞经过生长、分裂、分化，形成细胞团的全部过程。 缺点：微室培养用的培养基量少，营养和水分就难以保持。pH值变动幅度大，培养的细胞仅能短期分裂。 ;2.2 单细胞培养的影响因子;（1） 细胞密度与培养基成分关系 当细胞植板密度高时（104～105个/mL） 可使用和愈伤组织培养相同的常规培养基 当细胞植板密度低时 要求使用复杂培养基，常采用KM8P培养基或条件培养基，并结合使用看护培养、饲喂层培养等方法。;成分 数量（mg·L-1） 成分 数量（mg·L-1） 成分 数量（mg·L-1）;（2）细胞密度直接决定细胞分裂与否： ①细胞分裂要求细胞密度达到一定水平； ②细胞会产生某些物质，并分泌到培养基中，只有当这些物质在培养基中达到一定的临界水平，细胞分裂才启动。 ;生长因子;3、应用——筛选细胞突变体 3.1 突变体的特征 自然界突变体发生频率低 突变体继代多次都能稳定遗传 突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异 突变体细胞形成的再生植株能通过有性传递保证其突变型;3.2 获得突变体的方法 ⑴自发突变（体细胞无性系变异） 在组培过程中形成的再生植株表现出的遗传变异 特点：自发产生，无外在的选择压力；对于筛选目的突变体有一定的盲目性 适应材料：植物组培的培养物 ;⑵诱发突变 人为地采用物理和化学因素，诱发生物体产生遗传物质的突变，经分离、选择、培育成新品种的途径 方法：物理诱变、化学诱变 对象：种子、营养器官、离体培养材料（愈伤组织、单细胞、原生质体）;3.3 细胞突变体筛选的优点与意义（与整体植物相比） 培养细胞壁薄, 缺乏角质层和蜡质层，且处在不断分裂中， 比整体植物或种子更容易接受诱变； 细胞水平诱变周期短，缩短育种年限 ； 处理数目多，收率高； 避免了整株水平上常出现的嵌合体； 节省人力和物力进行选择，筛选效率高； ;3.4 细胞突变体筛选的技术路线： 选择起始材料，获得愈伤组织，制备单细胞悬浮系 人工诱变或自发突变 单细胞突变体