BMP7基因沉默抑制钙盐诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化.pdfVIP

BMP 7基因沉默抑制钙盐诱导猪主动脉瓣膜 间质细胞成骨分化 程瑜 施琼 安利钦 范梦恬 皇改改 翁亚光** (重庆医科大学检验医学院 临床检验诊断学教育部重点实验室 重庆 400016) 摘要 目的：探究小干扰RNA(small interferenceRNA，siRNA)介导的骨形态发生蛋白7(bone morphogeneticprotein7,BMP 7)基因沉默对钙盐诱导猪主动脉瓣膜间质细胞成骨分化的影响 及机制，为钙化性主动脉瓣膜病 （calcific aorticvalve disease，CAVD）的干预及治疗提供理 论依据。方法：非CAVD 瓣膜组织(non-CAVD 组)取自手术治疗的主动脉夹层患者，CAVD 瓣膜组织(CAVD 组)取自因钙化性主动脉瓣狭窄而进行主动脉瓣膜置换术的患者，采用免疫 组化和Westernblot 法检测non-CAVD 组和CAVD 组中BMP7、Runt 相关转录因子2(Runx2) 的蛋白表达水平。选取健康家猪处死后即刻于无菌条件下取主动脉瓣叶，采用胶原酶连续消 1 化法分离主动脉瓣膜间质细胞，观察其形态特征，并用免疫荧光染色行表型鉴定。采用脂质 v 体转染法将BMP7-siRNA 转染猪主动脉瓣膜间质细胞，采用qPCR 和Western blot 法验证 2 4 BMP7表达的变化;利用钙盐培养基诱导细胞成骨分化，建立体外主动脉瓣膜间质细胞钙化 6 模型后，采用ALP 染色和茜素红S 染色实验分别检测细胞早期及晚期成骨分化能力;采用 0 0 qPCR 和Western blot 法分别检测细胞成骨相关基因及蛋白Runx2、OCN 和OPN 的表达情 . 况。并用Westernblot 法检测BMP7 下游信号通路中Smad1/5/8 的磷酸化水平。结果：BMP7 2 1 和Runx2 蛋白在CAVD 组中表达明显高于non-CAVD 组。成功分离出原代猪主动脉瓣膜间 8 质细胞，α-平滑肌肌动蛋白 （α-SMA）及波形蛋白 （vimentin）染色阳性，血管性血友病因 1 0 子 （von Willebrand factor，vWF）染色阴性。转染BMP7-siRNA 后猪主动脉瓣膜间质细胞中 2 BMP7 的mRNA 和蛋白水平均明显下调，早期及晚期成骨分化能力均明显降低。沉默BMP7 : v 基 因的表达，可下调 Runx2 、OCN 和 OPN 的基 因及蛋 白表达，且磷酸化 的 i X Smad1/5/8(p-Smad1/5/8)蛋白水平明显降低。结论：BMP 7 基因沉默抑制钙盐诱导的主动脉瓣 a 膜间质细胞的成骨分化能力，BMP7/Smads信号通路可能在该过程中发挥重要作用。 n 关键词 钙化性主动脉瓣膜病；瓣膜间质细胞；BMP7；成骨分化；RNA 干扰 i h c 钙化性主动脉瓣膜病 （calcific aorticvalvedisease，CAVD）是主动脉瓣的退 行性病变，主要表现为瓣叶纤维增生与钙化导致瓣膜僵硬，严重者可发生钙化性 ［］ 1 主动脉瓣狭窄 （calcific aorticvalve stenosis,CAVS），引起左室流出道梗阻 。 随着人口老龄化，在发达国家CAVD 已经成为仅次于冠心病和高血压的第三大