第十六章放射性核素在分子生物学研究中的应用.doc

PAGE PAGE 252 第十六章 放射性核素在分子生物学研究中的应用 第一节 概述 分子生物学是研究生物大分子的结构与功能的一门学科。自从1953年Watson与Crick提出 DNA分子的双螺旋结构模型以来，基因的分子生物学迅猛发展，并于20世纪7 0年代建立了基因工程技术。这项技术与DNA序列分析技术的不断发展和完善，使人们得以在分子水平来揭示生命现象的本质，并且促进了工农业和医学的发展，成为新技术革命的重要支柱，20世纪被称为生命科学的世纪,生命科学的发展成果已经影响到人们生活的各个方面, 并正在改变着社会的未来。随着人类基因组计划的完成和其他生物和植物基因组计划的开展与完成，有关蛋白功能的研究更加引起人们的关心。在这方面的研究中，同位素技术仍然发挥着巨大的作用。 在分子生物学的发展过程中，放射性核素示踪技术起到了十分重要的作用。早在1952年，Hershey就利用32P标记的磷酸和35S标记的氨基酸作示踪剂，培养产生含32P标记DNA和35S标记外壳蛋白质的噬菌体，然后用这种标记噬菌体感染未标记的大肠杆菌，发现在细菌内复制产生的子代病毒中含有大量32P，而不含35S，从而证实，病毒遗传信息携带者是大分子DNA而非蛋白质。Meselson和Stahl用15NH4Cl培养基培养大肠杆菌，再利用超速离心方法证实，大肠杆菌繁殖过程中，子代细菌中DNA双螺旋分子的一条链是由亲代直接而来，另一条链是新合成的，DNA复制具有半保留特性。mRNA的首次分离及mRNA信息来自DNA也是应用同位素标记技术证实的。值得一提的是Nirenberg等的实验，他们首先人工合成由A、U、G、C中1～3种随机组成的多种三核苷酸，然后获得20种14C或3H标记的和非标记的氨酰基-tRNA。这样，在含有一个核糖体、所需研究的三核苷酸和14C或3H标记的20种氨酰基-tRNA中的某一种及其他19种非标记氨酰基-tRNA所组成的反应系统中，可以寻找出某种氨基酸与某种三核苷酸之间的对应关系，以三核苷酸代表mRNA上的一个密码，即可以确定大部分三核苷酸密码子的意义。核酸序列分析和核酸分子杂交中最常用的示踪手段是放射性核素示踪，尽管PCR技术的发展，可以用其他标记物作为研究手段，但同位素仍然有其不可替代性。 第二节 核酸标记技术 核酸结构分析研究中，常用放射性核素示踪技术；1975年以前，常用的放射性核素是3H和14C，而其后，32P标记物得到了广泛的应用，使得核苷酸顺序分析趋于微量化与简便化。35S也是常用的放射性核素之一，尽管S并非核苷酸中所含核素，但它与氧元素同属一族，常可用来代替氧原子。20实世纪90年代开始应用新型放射性核素33P。表16-1是几种核素之间的物理特性比较。 32P射线较强，容易检测；但辐射危害较大，半衰期较短，使用期较短，更主要的是电泳自显影条带有一些扩散，影响分辨率。而35S射线较弱，电泳后放射性自显影条带细窄而又清晰，分辨率高；但在自显影前必需先用酸固定凝胶，洗去变性剂尿素，再抽干凝胶。33P有其优越性，它的能量和半衰期居中，因而在制备高比活度的标记化合物时，无需特殊保护设备，使用也安全。由于它的能量比32P弱，相当于32P的1／5；尽管半衰期比32P约长一倍，但比35S短，因而在放射性自显影时，曝光时间适中，并且无需事先抽干凝胶，方便易行。此外125I也是常用的放射性核素。应用时可以根据需要和可能，选用适当的放射性核素。 表16-l 几种放射性核素物理性质比较 32P 33P 35S 射线 β— β— β— 半衰期（d） 14 25 87 最大能量（MeV） 1.7 0.25 0.17 条带分辨率 扩散 较好 清晰 操作 不需固定 不需抽干胶 需抽干胶、洗尿素 结论 较好 最好 可以 一、高放射性比活度的［γ-32P］ATP与［α－32P］dNTP的制备 ［γ-32P］ATP与［α-32P］dNTP是32P标记核酸的最重要的化合物，图16-1是ATP分子结构示意图。 αβ α β γ γ 图16-1 ATP分子结构示意图 标记时是把三磷酸核苷分子中α或γ位置上的P原子用32P替换下来。为了获得高放射性比活度化合物，常利用酶促反应并加上无载体32P来合成［γ-32P］ATP。反应式如图16-2所示。 图16-2 ［γ-32P］ATP合成反应式 这是利用生物体内糖代谢的反应来合成所需要的［γ-32P］ATP。其中第1步为不可逆反应，而第2步是可逆反应，如果在反应体系中加入过量ATP，将使反应逆转，而得不到所需产物。此反应一般在半小时内即可完成，用EDTA终止反应。为了提高放射性比活度，目前对这一反应体系作了一定的修改，即不用氧化染料，而以丙酮酸及乳酸脱氢酶反应代替，以便维持较高浓度的NAD+；同