外源多肽在Salmonellaenteritidis菌毛上的高效表达.PDFVIP

外源表位在Salmonella菌毛上的表达 黄鹤1,2 李若寒2,3 张雅琦2,3 刘树林1 王月丹1,2 1 北京大学医学部基础医学院（100083） 2 北京大学医学部生物医学实验教学中心病原与免疫综合实验室（100083） 3 首都师范大学生物技术系 （100085） Email: Immunology@ 摘要： 细菌菌毛作为表达载体用于表达外源多肽或蛋白有诸多优势，加拿大 Calgary 大学 的 Aaron P White 博士运用一项特殊的表达技术成功地在沙门氏菌菌毛上表达了一段外源 表位并能够被抗体识别。这项技术的应用可能对疫苗的研究带来新的促进作用。 关键词： 沙门菌 菌毛 表面表达展示 疫苗 1. 引言 外源蛋白展示表达于细菌表面首次报导是在上世纪 80 年代中期，外源小片断被插入到 [1] [2] [3] Escherichiacoli的膜蛋白LamB ，OmpA ，PhoE 基因中，并且在菌体表面得到了表达。自 此，菌体表面表达得到很大重视，膜蛋白、脂蛋白、菌毛蛋白、鞭毛蛋白都被用于蛋白表达 [4] [5] 展示 ，而且不仅仅用于革兰阴性菌，革兰阳性菌的应用亦有报导 。细菌菌毛在菌体表面 的表达量可以高达 500个拷贝，每个拷贝可以有上千个主要亚基构成。而且菌毛结构致密稳 定。如果外源抗原多肽基因可以插入到这些亚基的基因中，表达量大而且稳定。因而在理论 上无论是要经过细菌吞噬裂解这一过程还是直接提呈给免疫系统，都更易于被免疫系统识 别。实际上已经有多种菌毛蛋白得到应用，比如K88，CS31A，I型菌毛等[6]。本文将介绍一 种沙门氏菌菌毛的高效展示表达方法，这个方法在疫苗的研究方面有一定的应用前景。 2．Salmonellaenteritidis 菌毛展示表达体系 此表达体系由AaronP.White所在的小组构建，第一次用于表达来自Leishmaniamajor 的抗 [7] [8] 原表位PT3 ，文章发表于 1999 年，之后他们对机制做过一些研究 ，并且用于比较热门的 基因敲除上。该体系使用的菌株是Salmonellaenteritidis3b ，以不稳定的、热敏感的质粒 pHSG415 为基因重组的载体，通过同源重组方式将外源基因插入到细菌agfA和sefA菌毛基因 中，从而使外源基因在菌毛上得到表达。实验结果显示agfA作为载体取得了较好结果，而sefA 结果不太好。这个表达体系是怎样得到实现的将在下文详细介绍（以展示表达PT3 为例）。 2.1 基因置换位点的选择和外源 DNA 的选择 Salmonella菌毛蛋白由 3 个亚基组成，agfA 、agfB和agfC （agf也被称为csg ），其中agfA 是主要亚基。关于菌毛的组装有多种理论，最终成百上千的agfA亚基螺旋延伸组成了菌毛的 基本形态。agfB位于菌毛和外膜的连接部分，agfC 的功能尚不清楚。agfA 由 131 个氨基酸残 [8] 基构成，通过同源性对比和结构预测发现实际上是由5 段重复序列形成平行的β螺旋结构 。 基因置换位点的选择基于PT3 和agfA的氨基酸序列对比、亲水性分析，结构弹性分析，B细 胞表位作图。最后划分出 10 个区域，命名为A1 －A10 ，实验证明置换这些区域得到的表达 效率不一样。虽然这些区域结构上有很大的“弹性”，但是外源DNA不能过长，如果太长 势必影响菌毛蛋白结构的正确形成，White博士最长插入 25 个氨基酸的多肽。同时为了保证 1