课件：FISH.pptVIP

THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 间期细胞遗传学的意义：细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养获得中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。 染色体涂染探针 染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针 探针来源： （1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)体细胞杂种组织融合的产物； （2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆/PCR扩增； （3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增； 应用　（1）染色体数目和结构异常分析； 　（2）不同物种间的同源性比较； 　（3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。 染色体涂染探针人类染色体结构分析 染色体结构异常分析 多色复合染色体FISH探针 多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex FISH, M-FISH probes) 两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统，通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。 多色复合染色体FISH探针 探针及标本的变性 1）探针变性 将探针在75oC恒温水浴中温育5min，立即置0oC，5～10min，使双链DNA探针变性。 2）标本变性 ①将制备好的染色体玻片标本于50oC培养箱中烤片2～3h。 ②取出玻片标本，将其浸在70～75oC的体积分数70％甲酰胺/2×SSC的变性液中变性2～3min。 ③立即按顺序将标本经体积分数70％、体积分数90％和体积分数100％冰乙醇系列脱水，每次5min，然后空气干燥。 杂交 将已变性或预退火的DNA探针10μL 滴于已变性并脱水的玻片标本上，盖上18×18盖玻片，用Parafilm封片，置于潮湿暗盒中37oC杂交过夜（约15～17h）。 由于杂交液较少，而且杂交温度较高，持续时间又长，因此为了保持标本的湿润状态，此过程在湿盒中进行。 洗脱 此步骤有助于除去非特异性结合的探针，从而降低本底。 （1） 杂交次日，将标本从37oC温箱中取出，用刀片轻轻将盖玻片揭掉。 （2） 将已杂交的玻片标本放置于已预热42～50oC的体积分数50％甲酰胺/2×SSC中洗涤3次，每次5min。 （3） 在已预热42～50oC的1×SSC中洗涤3次，每次5min。 （4） 在室温下，将玻片标本于2×SSC中轻洗一下。 （5） 取出玻片，自然干燥。 （6） 取200μL复染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。 （1） 在玻片的杂交部位加150μL封闭液I，用保鲜膜覆盖，37oC温育20min。 （2） 去掉保鲜膜，再加150μL avidin-FITC于标本上，用保鲜膜覆盖， 37oC继续温育40min。 （3） 取出标本，将其放入已预热42～50oC的洗脱液中洗涤3次，每次5min。 （4） 在玻片标本的杂交部位加150μL封闭液II，覆盖保鲜膜，37oC温育20min。 （5） 去掉保鲜膜，加150μL antiavidin于标本上，覆盖新的保鲜膜，37oC温育40min。 （6） 取出标本，将其放入已预热42～50oC的新洗脱液中，洗涤3次，每次5min。 （7） 重复步骤(1)、（2）、（3），再于2×SSC中室温清洗一下。 （8） 取出玻片，自然干燥。 （9） 取200μL PI/antifade染液滴加在玻片标本上，盖上盖玻片。 杂交信号的放大（适用于使用生物素标记的探针） 可采用不同类型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液产生自封闭作用），为防止盖片与载片之间的溶液挥发，可使用指甲油将盖片周围封闭。封好的玻片标本可以在-20～-70oC的冰箱中的暗盒中保持数月之久。 封片 先在可见光源下找到具有细胞分裂相的视野，然后打开荧光激发光源。 FITC的激发波长为490nm。细胞被PI染成红色， 经FITC标记的探针所在的位置发出绿色荧光。 荧光显微镜观察FISH结果 所用不同荧光材料的激发光和发射光波长及滤光镜选择 FISH技术的应用 FISH技术的应用1）基因（或DNA片段）的染色体定位；2）染色体数目与结构异常的检测；3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与诊断）；4）肿瘤遗传学研究 FISH的