病毒血凝抑制试验的操作方法.ppt

鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价 目的 1、掌握鸡新城疫的临诊要点。 2、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。 内容 1、鸡新城疫的临诊要点。 2、鸡新城疫的实验室诊断。 NDV的分离及鉴定； NDV毒力的鉴定 3、鸡新城疫的免疫效果评价 鸡新城疫的免疫监测 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI) 血凝试验（HA）和血凝抑制试验 (HI) HA和HI的原理 ⒈HA试验：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受体结 合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象?。 2.HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。 一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【材料】 新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 1份 0.5％鸡血球悬液 1管 生理盐水或PBS 1瓶 96孔微量血清盘 1块 微量加样器 1支 ? 一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【方法与步骤】 （一）制备鸡红细胞悬液： 1.用注射器抽取抗凝剂。 ? 2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血。 3.混匀，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心三次（第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分 5分钟）洗去血清及白细胞。 ⒋ 取纯红细胞0.6ml，加生理盐水稀释99.4ml，即成1%的鸡红细胞悬液。 一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【病毒血凝试验的操作方法（单位：?L）】? 一、鸡新城疫的血凝试验(HA) 【 结果判定 】 置于振荡器上振荡1分钟，静置后30 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。 以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。? 二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI) 【材料】 除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。 鸡群卵黄抗体的制备 1.取鸡蛋卵黄20ml，加入等量生理盐水，振荡，摇匀。 2.加入等量氯仿40ml，振荡30分钟。 3.取振荡的卵黄液3000～4000rpm30分钟。 4.取上清液作为抗体检测材料 二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI) 【方法】 1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。 2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50?L生理盐水。 3.自第3孔至12孔各加50?L 4个血凝单位的新城疫病毒液。 4.第１孔加被检鸡血清50?L，吹吸混合均匀，吸50?L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50?L，稀释度分别为：1:２、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性血清50?L，作为血清对照。振荡混合均匀，置室温中作用20min 。 5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50?L，振荡混合均匀，室温下静置30-40min后观察结果 二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI) 二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI) 【结果判定】 以100％抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。 从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。 * * （二）加样 1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50?L生理盐水。 2. 于左侧第1孔加50?L病毒液，混合均匀后，吸50?L至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50?L；第12孔为红细胞对照。 3. 自右至左依次向各孔加入0.5% 鸡红细胞悬液50?L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。 - - + + +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 结果观察 微型振荡器1min，静置30min 弃50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 0.6%红细胞 50