实验五 流式细胞术 Flow Cytometry 的原理及应用.pptx

DEPARTMENT OF IMMUNOLOGY实验五 流式细胞术(Flow Cytometry)的原理及应用细胞染色（流式细胞术）?1.收集细胞：取细胞总数约1×～ 5× 脾脏细胞 至于1.5mlEp管中（在管盖上标记好组别），5000rpm，4℃，5min（离心机需预先降温）2.染色：小心用枪去除上清，再加入50ul预混抗体的PBS（由助教准备），将细胞吹打混匀，避光， 4℃或冰上，染色15-20min3.清洗：加500ul的PBS，吹打混匀后，5000rpm，4℃，5min4.检测：小心用枪去除上清，再加入500ul PBS，吹打混匀，至于冰上，待流式仪检测流式细胞术调整仪器设置收集数据分析结果课堂目标了解流式细胞仪的构造、原理及应用，掌握“门”，“补偿”两个基本概念。学会简单分析流式数据：小鼠脾脏分离的单个核细胞中CD3+、CD4+ 、CD8+细胞的比例。Content流式细胞仪的简介流式细胞仪的组成及原理流式细胞术的应用流式细胞术实验操作流程及数据分析什么是流式细胞术？ 流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种快速、准确、客观的同时检测直线流动状态中单个细胞多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。检测速度快，分析样本量大在极短时间内可分析大量细胞，这是流式不同于其他细胞分析仪器的主要特点，可以每秒钟上万个细胞的速率进行测量。可检测的样本种类多样各种细胞（如外周血，骨髓，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球。FACS - Fluorescence Activated Cell Sorting样本类型可检测颗粒大小0.2μm50μmSSC Fluorescence DetectorsIncident Light SourceFSC Detector 流式细胞仪能检测哪些信息?相对大小: Forward Scatter (FSC)相对颗粒度或内部复杂程度: Side Scatter (SSC)通过荧光强度可以分析：细胞表面标志物细胞内部因子细胞分泌因子DNA含量等……Part II流式细胞仪组成及原理流式细胞仪组成Fluidics (液流系统)流体动力学聚焦样本形成单细胞流Optics (光学系统)激发和收集光信号Electronics (电子系统)扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑液流系统（Fluidics）液流系统将样本悬液聚焦在光源的中心处检测光源488 nm laser过滤网废液桶鞘液桶样品管液流系统: 流动室(Flow Cell)光学系统（Optics）激发系统 Excitation optics:激光器 laser透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区收集系统 Collection optics:光学镜片和滤光片光信号检测器Optics SubsystemDetectorarraysFiber optics488 nm405 nm640 nmCollection lensLaserLaserLaserFSC diodeLensFlow cellSample coreExcitation optics电子系统（Electronics）光信号被转换成电信号，并进行合适放大.电信号脉冲被分析和计算，补偿运算.模拟信号被转换成数字信号.数据转移并被存储于电脑中.直方图(Distribution Histogram)横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是对数，可以是线性或对数坐标。纵坐标一般是细胞数。散点图(Dot Plot)X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一参数的含量，可以将细胞亚群分开。流式原理总结流式能够提供的信息包括：颗粒的相对大小，内部复杂程度，和标记上去的荧光强度.颗粒由液流包裹到达检测区，产生信号.检测系统将光信号转换成电信号.每个颗粒的信息存储成数据格式，记录下来.前向角散射光（FSC）当细胞颗粒通过聚集的激光束时，激光向各个方向散射。与激光束方向同轴的称前向角散射光信号（FSC）。FSC一般表征细胞相对大小及其表面积。侧向角散射光（SSC）与激光束垂直的称为侧向角散射光信号（SSC）。SSC一般表征细胞粒度及细胞内相对复杂性。散射光信号，散点图 (Dot Plot)Part III流式细胞术的应用流式细胞术应用 细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内/外的细胞因子激素结合位点、细胞受体蛋白磷酸化pH值钙离子浓度细胞膜电位、线粒体膜电位 …… 细胞结构细胞大小细胞颗粒度细胞表面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量……流式细胞仪的临床应用HIV免疫分型，CD4绝对计数白血病和淋巴瘤的免疫分型肿瘤的细胞周期和倍体分析网织红细胞计数细胞移植的交叉配型和免疫状态监测干细胞计数残量白血病细胞检查HLA-B27