第六讲 酶与细胞的固定化技术.pptVIP

(2)固定化动物细胞特点 ①由于有载体的保护作用，可以减轻或免受剪切力的影响，同时动物细胞可附着在载体的表面生长，可显著提高动物细胞的存活率，也可反复使用或连续使用较长的时间； ②动物细胞经固定化后，可先在生长培养基中生长繁殖，使细胞在载体形成最佳分布并达到一定的细胞密度，然后可简便地改换成发酵培养基，控制发酵条件，使细胞从生长期转变到生产期，以利于提高产率； ③固定化动物细胞易于与产物分开，利于产物的分离纯化，提高产品质量。 (3)固定化动物细胞的应用 固定化动物细胞应用广泛，特别是采用微载体对动物细胞进行吸附固定化，其主要用于生产小儿麻痹症疫苗、风疹疫苗、狂犬病疫苗等疫苗，生长激素、干扰素、白细胞介素、促性腺激素等激素，血纤维溶酶原激活剂、胶原酶等酶类，抗菌肽等多肽药物。 4、细胞器的固定化 活细胞中存在的酶常与不同种类的生物大分子结合，形成超分子体系，如膜、脂蛋白以及核糖体等。特别是在真核生物中，这些超分子体系能组装成细胞器和各种细胞结构，如核、线粒体、叶绿体、微体、内质网等。 许许多多的细胞代谢反应，如生物分子中ATP的生成和生物分子的合成与降解，都是在膜围绕的细胞结构或直接在膜上分开或组合进行的。 因此，如果将分离的细胞器进行固定，就可使之在执行序列生物反应时，成为一种重要的优良生物催化剂。但是，对细胞器的固定化并不容易，除叶绿体的固定化外，只有少数报道记载了其他细胞器的固定。 一些细胞器的固定化 叶绿体细胞器的固定化方法 聚丙烯酰胺凝胶法 聚乙烯醇 蛋白质截留法 海藻多糖截留法 聚丙烯酰胺凝胶法 制备聚丙烯酰胺凝胶(PAG)常用的试剂有丙烯酰胺单体、N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)和作为聚合作用引发剂和聚合作用加速器的过硫酸盐等。 制备叶绿体时，无论加入哪一种试剂，均对光系统Ⅱ(PS Ⅱ)活性影响很小。叶绿体与这些试剂混合时，会发生凝胶化，常常使它的活性完全丧失，这表明试剂混合时形成的原子团对PS-Ⅱ的组分具有损害作用。 活性光合系统的固定化可用氧化还原聚合法给以实现，即将丙烯酰胺单体(最终浓度为15％)、BIS(0．8％)、聚合引发剂(0.02％)、抗坏血酸(0.06％)、牛血清白蛋白(BSA，1％)、用作防护剂的D甘露醇(0.01％)和叶绿体悬浮液，在厌氧条件下，于10℃培养2h，经过挤压和用冷的STN缓冲液洗涤之后，得到的绿色凝胶小球具有专一活性光系统I(PS-I)和PS-Ⅱ。 聚乙烯醇 将叶绿体悬浮液置于含有STN的缓冲液中，再与20％PVA-105相混合，将此黏状溶液缓慢地捏合，然后置于暗处减压干燥，最后形成泡沫结构的物质，此物质可以捣碎呈薄片，易于储藏。这种干的片状固形物易于溶解在缓冲液中，形成的悬浮液犹如原来的天然状态。 PS-I活性的回复率与天然叶绿体的等量；而P-Ⅱ的活性为天然叶绿体的80％以上。实验表明，薄片中的PS-I和PS-Ⅱ活性均可保留5周，其活性的丧失率少于20％。以吩嗪二甲基硫酸盐为媒介的循环光合磷酸化作用，也可以借助于使用薄片状固形物PVA叶绿体重新制备的悬浮液进行。即使在冷、暗条件下储藏2周后叶绿体的活性仍可达lmg叶绿体产ll7μmol ATP／h(为对照的44％)。 蛋白质截留法 Vieth等将剥离的叶绿体置于pH8.5的4％(质量分数)胶原蛋白溶液中扩散，干燥后此混合物形成薄膜。如果必要，还可用戊二醛处理使之达到要求的机械强度。用此法固定的叶绿体放出的氧气大约是游离叶绿体活性的一半。在活性保持中最重要的因素是鞣制的条件，也就是所用的戊二醛浓度及处理时间。储存2周后，由胶原蛋白截留的叶绿体仍保留其初始活性的60％。 海藻多糖截留法 采用藻朊酸钙固定能提供温和的条件。Kierstan等首次报道了将用藻朊酸钙固定的叶绿体置于强化的尼龙栅条和不锈钢条上，形成一种强化膜．可制喊不同的产H2体系，包括藻朊酸钙叶绿体与氢化酶或PVA-铂的共同固定化制品，以及生物的或合成的电子载体。在有O2存在的条件下进行光照时，每毫克叶绿体可靠的产H2量为5μmol／h。虽然其初速度比游离的对应系统少一半，但产H2系统的寿命可延长2倍。l979年，Berexin等研究琼脂凝胶截留叶绿体的性质，说明截留的叶绿体的不可逆转的钝化作用随琼脂强度而变，在低浓度的条件下，叶绿体在凝胶内更为稳定。 二、固定化细胞生长和产酶动力学 1、固定化细胞生长动力学 在适宜的培养基和培养条件下培养，固定在载体上的细胞能以一定的速度生长。随着细胞的生长和繁殖，有一些细胞脱落到培养液中，而成为游离细胞，它们也在培养液中生长繁殖。所以在固定化细胞的培养系统中，包括两部分细胞：一部分是固定在载体上的细胞；另一部分是游离细胞。因此其生长速率也由两部分组成，即： dx dt dx dt dx dt =