分子生物学常用技术与应用.pptVIP

（二）探针的种类与制备 1、基因组DNA探针——直接从基因组分离 2、cDNA探针——通过逆转录生成 3、寡核苷酸探针——人工聚合成 4、RNA探针——转录生成 （三）探针的标记物 放射性标记物：32P、35S、3H、125I、131I 非放射性标记物：生物素、地高辛、荧光素、酶 （四）标记方法 体内标记法：将标记物掺入培养基 体外标记法：化学法或酶法 第三节 聚合酶链反应 polymerase chain reaction 聚合酶链反应（PCR） ——体外高效、快速、特异地扩增 目的基因或DNA片段的技术。 一、PCR 的基本原理 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增 DNA的体内复制： 原料：模板DNA（基因组DNA）， 随机小分子RNA引物，dNTPs 酶：DNA聚合酶，解旋酶，引发酶 反应条件：胞液环境，37 ℃ 反应过程：模板DNA解旋、引发体的形成、延长（三阶段） 产物：模板DNA （基因组DNA）拷贝数增加一倍 原料：模板DNA（基因组DNA ，cDNA） 一对特异性寡核苷酸引物，dNTPs 酶：Taq DNA聚合酶 反应条件：合适的缓冲液，三种变化的温度（94，50-70，72 ℃），一定的循环数（25-35） 反应过程：DNA模板变性（解链）、 模板与引物退火 、引物延伸 （三阶段，多循环） 产物：目的DNA（特异性）拷贝数增加2n倍. PCR 二、过程（经典操作过程）1、高温变性（DNA模板变性） 与体内DNA解链过程不同，PCR中作为模板的双链DNA是通过95℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA 2、低温退火（模板与引物退火） PCR通常需要两条寡核苷酸链作为DNA合成时的引物（primer）,这两个引物分别与待扩增模板DNA的目标片段两端的序列互补。在降低温度的过程中（一般为70-75 ℃ ，通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。 primers ⑴引物短，不易缠绕； ⑵设计的引物是与模板DNA两端序列互补； ⑶引物的量远大于模板分子的量，引物与模板DNA形成双链的几率远远高于DNA分子自身的复性。 3、适温延伸（72 ℃） 在PCR反应体系中的DNA聚合酶，能够催化反应体系中游离的单核苷酸（dNTPs）由引物5→3方向，按碱基配对的原则延伸，形成两条与模板DNA互补的复制链。 Taq 酶 dNTPS 新合成的链又可作为下轮循环反应的模板。 热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环 每一循环后的模板均比前一循环增加1倍。理论上讲，扩增DNA产量是呈指数上升的，即n个循环后，产量为2n拷贝。而实际上，PCR的扩增倍数为（1+X）n，X为扩增效率，平均为75% 热变性-复性-延伸 25-35 次循环 百万倍扩增 尽管PCR扩增DNA非常有效，但目的DNA序列的指数扩增并不是一个无限制的过程。 在正常的反应条件下，经30次循环之后，酶的催化反应趋于饱和，就会出现平台效应 (Plateau) ，产物的量不再增加。 “平台效应”出现的迟早还取决于酶的性能、模板DNA的拷贝数、dNTP浓度等多种因素。 RT—PCR 以mRNA为原始模板的PCR，亦称逆转录PCR。 逆转录反应在42 ℃进行，随后将反应混合物加热至95 ℃5min，灭活逆转录酶，取2ul反应产物，按DNA为模板的PCR反应步骤，进行扩增反应。 三、PCR在医学中的应用 对人类遗传信息的认识和研究 基因工程药物与疫苗生产 转基因动物和植物制造 基因诊断与基因治疗 镰刀型红细胞贫血 Chehab等设计一对引物把含有突变的DNA片段（共294bp）扩增，扩增产物用限制性内切酶 OxaN I消化，琼脂糖凝胶电泳后染色观察： 正常人有2个片段，191 和 103bp， 镰刀状红细胞贫血的 纯合子，仅有一个片段294bp 杂合子有191、103和294bp 3个片段 综合了分子生物学、微电子学、微加工和计算机等学科知识 本质：在固定的玻片等载体上的微型生物化学分析系统，芯片上每平方厘米可排列成千上万生物分子，能快速准确地检测核酸，并获取样品中的有关信息。 第四节 DNA芯片技术 一、DNA芯片技术的概念和主要类型 DNA芯片技术——指将大量已知寡核苷酸或DNA探针（不标记）按特定的排列