SDS-PAGE实验（焦庆昉、邓小园）.ppt

* SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 邓小园 基础医学院生物化学与分子生物学教研室 实验目的 学习利用SDS测蛋白质的分子量。 实验原理 电泳是指带电粒子在电场的作用下，发生定向泳动的现象。 电泳技术指利用电泳现象对混合物进行分离分析的技术。 蛋白质N端游离氨基，C端游离羧基以及侧链上一些基团在一定pH条件带电荷， 因此可以用电泳技术分离和鉴定 COO- COO- COOH ╱ + H+ ╱ + H+ ╱ Pr ←————→ Pr ←————→ Pr ╲ + OH- ╲ + OH- ╲ NH2 NH3+ NH3+ PHPI PH=PI PHPI 电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶电泳基本原理：聚丙稀酰胺是由丙稀酰胺和N,N’-亚甲基双丙稀酰胺经共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸胺（AP）激发的。被激活的单体和未被激活的单体开始了多聚链的延伸，正在延伸的多聚链也可以随机地接上双丙稀酰胺，使多聚链交叉互连成为网状立体结构，最终多聚链聚合成凝胶状。  SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。 这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小 影响电泳速度的因素 样品本身：带电量，分子大小，形状 电场强度：电压 电泳介质的pH和离子强度 凝胶网络的孔径 实验材料和仪器 丙烯酰胺 丙烯酰胺是一种白色晶体化学物质，是生产聚丙烯酰胺的原料，易溶于水。具有毒性作用：刺激皮肤和神经系统 甲叉双丙烯酰胺交联剂 甲叉双丙烯酰胺，是一种白色晶体粉末，无味，吸湿性极小。遇高温或强光则自交联，微溶于水、乙醇。 过硫酸铵（AP） 过硫酸铵是一种白色、无味晶体，常作强氧化剂使用，也可用作单体聚合引发剂，极易潮解。过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。 四甲基二乙胺（TEMED） 无色液体，有异味，对光敏感，应避光保存。丙烯酰胺聚合成凝胶的催化剂 十二烷基硫酸钠（SDS） SDS是一种阴离子去污剂，带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而可利用分子量差异将各种蛋白质分开。 β-巯基乙醇 有特殊气味，可将蛋白质的二硫键断裂，形成单链多肽，保证结合SDS后，单位肽链长度带相同点荷 考马斯亮蓝 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 实验器材 垂直板电泳装置 直流稳压电源 移液管 滤纸 微量注射器 大培养皿 实验步骤 1.试剂配制 实验管理人员，已配好，无需配制，具体配制方法，参考教材P79-P80 2.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干，把玻璃板在灌胶支架上固定好 3.配制灌注聚丙烯酰胺凝胶-10%分离胶 分离胶缓冲液 2.5ml 蒸馏水 12.25ml 30%分离胶储存液 4.9ml 10%AP 100μl SDS 200μl TEMED 50μl 按比例配好分离胶,用移液管快速加入，直至距样品模板梳齿下缘1cm,之后加少许蒸馏水约3~4mm。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。 加水膜 灌注分离胶 水封的目的是为了使分离胶上延平直 分