法洛氏四联症患者心脏mirna表达分析及通用taqman探针检测mirna方名法的建立和应用.docxVIP

复 复 口.大 学 硕 }:学 位 论 文 中 文 摘 要 ( 3 ) 因 为 样 本 收 集 的 困 难 ， 对 照 组 和 病 例 组 样 本 间 存 在 年 龄 差 异 ， 而 m iR N A 的 可 以 根 据 发 育 阶 段 的 不 同 存 在 表 达 差 异 。 为 了 排 除 年 龄 差 异 造 成 的 影 响 ，我 们 在 10 天 龄 C 57 小 鼠 和 2 一3 个 月 C 57 小 鼠 的 心 脏 组 织 中 对 结 果 进 行 检 测 ， 发 现 8 个 m iR N A 存 在 随 年 龄 变 化 表 达 量 存 在 差 异 。 ( 4 ) 为 了 寻 找 m iR N A 对 法 洛 氏 四 联 症 发 病 的 发 病 机 制 的 影 响 ， 我 们 预 测 了表 达 量 变 化 的 m iR N A 的 可 能 的 靶 基 因 ， 并 通 过 双 荧 光 报 告 基 因 方 法 对 靶 基 因 进 行 了初 步 筛 选 。 结 论 在 法 洛 氏 四 联 症 的 患 者 中 ， m iR 一36 3 、 m iR 一4 2 4 、 m iR 一4 2 4 * 、 m iR 一18 Ic 和 m iR 一18 ld 的 表 达 上 调 。 并 验 证 N F I和 H A S Z 是 m iR 一4 2 4 的 靶 基 因 ; P A X 3 和 H A S Z 是 m iR 一3 6 3 的 靶 基 因 。 第 二 部 分 近 年 来 Ini R N A 对 靶 基 因 的 调 节作 用 的 研 究 己 成 为 热 点 ， 大 多 数 m iR N A 功 能 还 小 i青楚 ， 所 以 建 立 敏 感 特 异 的 检 测 力一法 ， 并 了解 各 种 m iR N A 在 组 织 ‘卜的 时 空 分 布 情 况 ， 是 理 解 其 作 用 的 关 键 步 骤 。 传 统 的 N o rthe m Bl ot等 方 法 山 于 操 作 的 复 杂 性 和 低 敏 感 性 逐 渐 被 高 通 量 的 ， 灵 敏 的 检 测 方 法 一实 时 定 量 P C R 一所 代 替 。 但 是 由 于 m iR N A 长 度 只 有 2 2一25 ni ， 很 难 用 常 规 方 法 检 测 ， 只 有 通 过 特 殊 的 设 计 ， 所 以m iR N A 检 测 方 法 成 为 其 功 能 研 究 中 的 一 大 难 题 。 目前 用 于 检 测 m iR N A 的 R T 一P C R 方 法 主 要 有 : 茎 环 P C R 方 法 、 延 长 引 物 P C R 方 法 和 通 用 引 物 方 法 。其 中 前 两 种 都 是 根 据 特 定 的 m iR N A 序 列 设 计 反 转 录 引 物 ， 还 需 要 根 据 特 定 的 反 转 录 引 物 进 行 而 R N A 的 检 测 ， 不 仅 工 作 量 大 ， 而 且 费 用 高 昂 。 现 在 常 用 的 为 通 用 引 物 R T 一P C R 方 法 ， 我 们 在 此 基 础 上 进 行 了 改 进 ， 使 通 用 反 转 录 引物 序 列 加 长 并 且 本 身 末 端 可 以形 成 茎 环 结 构 ，目的 是 防 止 在 低 退 火 温 度 时 引 物 木 身 I了_补 ， 而 且 可 以 根 据 此 序 列 设 计 通 用 卜游 引 物 和 通 用 检 测 探 针 序 列 。 在 实 时 定 量 p C R 检 测 方 法 中 ， T aq M an 探 针 法 和 S Y B R G reen 法 都 是 比较 常 用 的 方 法 。T aq M an 探 钊‘具 有 高 度 的 特 异 性 和 滩 确 性 ， 但 是 山于 要 针 对 每 个 检 测 目 衍;设 计 探 针 ， 其 价 格 昂 贵 ， 从 l(fJ 限 制 了它 的 的 )、划 }J 。 }自J传 统 s Y B R G ree n 染 料 法 的 特 异 性 低 ，荧 光 染 料·能 不l一子日【!Jd SD N A 结 合 。1大!此 它 也 能 ‘。!}特 异 的 d sD N A ( 如 引 物 飞聚 体 ) 结 合 ，使 其 实 验 容 易 产 ’卜假 阳 性 信 号，了以足 山 J几操 作 方 便 和 成 本 较 低 l(J1受 到 J」‘泛 的 I’J’’.f味 。 所 以 ， 义、J J几T aq M a ;1探 全}‘法 不「}s Y B R G ree，1法 的 比 较 ， 并 不 能 确 定 哪 种 方 法 !，:一丫J’绝 对 的 优 势 。为 了 子 找 种 既 !lJ’以 保 计检