基因操作原理02.ppt

Enzymes: Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631  Enzymes: Restriction Enzymes 3601 Type I 51 Type II 3540 Type III 10 Methyl-Directed 4 Weirdo REs 1 Putative REs 631  3.平端连接 PvuII(CAGCTG)+EcoRV(GATATC) MobI (GATC) 十一、酶切位点在基因组中分布的不均一性 GC% 酶切位点出现的机率 BamHI GGATCC EcoRI GAATTC 在基因组中，碱基对的排列是非均匀的 因此尽管GC含量相同的酶切位点，在基因组中出现的机率是不一样的 平均片段大小在E.coli AscI(GGCGCGCC) 20kb NotI(GCGGCCGC) 200kb EcoRI/HindIII 5kb SpeI(ACTAGT) 60kb ·细菌基因组 在大多数富含A+T的细菌中，CCG和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的机率就非常少 ·酵母基因组 G+C%为38%，因此在重复序列之外(tRNA or Ty elements)，富含G+C的识别序列就特别少 哺乳动物细胞核基因组的G+C为41%，其中CG的序列比想象的低5倍之多，因此含CG序列的酶切位点在哺乳动物细胞就相当稀少。 但是在哺乳动物细胞中，大多数CG序列是甲基化的 第二章 工具酶 第一节 限制性内切酶 一、限制与修饰 二、限制性内切酶识别的序列 三、限制性内切酶产生的末端 四、末端长度对切割的影响 五、位点偏爱 (site preferences) 七、星星活性(star activity) 六、酶切反应条件 八、单链DNA的切割 第二节 甲基化酶 Methylase Methylation methyltransferase 一、甲基化酶的种类 在真核和原核生物中存在大量的甲基化酶， 在E.coli中大多数都有三个位点特异性的DNA甲基化酶 1. Dam甲基化酶 GATC 腺嘌呤N6位置 引入甲基 PvuII BamHI BclI BglII XhoII MboI Sau3AI 识别位点中含GATC序列 ClaI(1/4) XbaI (1/16) TaqI (1/16) MboII (1/16) HphI(1/16) 部分识别序列含GATC序列 4个ClaI位点(ATCGATN)中有一个该序列 有些限制酶对Dam甲基化敏感 不能切割相应的序列 BclI, ClaI, MboI, XbaI 等 不敏感的有 BamHI, Sau3AI, BglII, PvuI等 一般哺乳动物DNA 不会在A-N6上甲基化 当需要在敏感位点上完全切割DNA时，必须从dam- E.coli中提取DNA 2. Dcm甲基化酶 识别CCAGG或CCTGG序列 在第二个C上C5位置上引入甲基 EcoRII / BstNI CCA(T)GG 二者识别序列相同，但切点不同 EcoRII受dcm甲基化作用影响 BstNI可避免这一影响 受影响酶有： Acc65I GGTACC AlwNI ApaI GGGCCC EcoRII EaeI 等 不受影响酶有： KpnI GGTACC BanII Bg1I BstNI NarI GGCGCC 等 3. EcoKI甲基化酶 识别AAC(N)6GTGC TTG(N)6CACG A N6位置 但识别位点少(1/8kb) 研究较少 而dam（1/256bp） dcm(1/512bp) 4. SssI甲基化酶 来自原核生物Spiroplasma CG序列中的C在C5位置上甲基化 可在未甲基化或半甲基化链上起作用 许多酶对此甲基化敏感 AatII ClaI XhoI SalI等 不敏感的有BamHI EcoRI SphI KpnI SssI甲基化的DNA 受E.coli McrA, McrBC, Mrr 系统的限制 5. 其它甲基化酶 二、依赖于甲