甘油氧化酶高产前菌株的筛选 酶的分离纯化及酶学性质分析.docxVIP

摘要摘 摘要 摘 要 甘油氧化酶(Glycerol Oxidase，GLOX)在氧气存在的情况下，可将甘油氧 化为甘油醛，同时产生过氧化氢。甘油氧化酶可以替代甘油激酶和甘油磷酸氧 化酶对血液中的甘油三酯进行测定。甘油氧化酶还可将乙二醇经由羟乙醛氧化 为乙二醛，可将乙醇酸氧化为乙醛酸。因为酶催化反应的速度快，无副产品产 生，如将其用于工业生产乙二醛和乙醛酸，具有广泛的应用前景。 日本曲霉(Aspergillus japonicus)是半知菌纲的丝状真菌，是产生甘油氧 化酶的重要菌种。为了提高甘油氧化酶的产量，本研究首先利用根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)介导T-DNA转化真菌引起插入突变的原理，构建 了日本曲霉突变体文库，对该文库中的332株日本曲霉转化子进行甘油氧化酶 产量检测，筛选到4株产量提高的转化子，其中njyz0079较初始菌株As5999 甘油氧化酶产量提高了50％，摇瓶条件下Ajyz0079甘油氧化酶活力达到 10．02U。 对日本曲霉生产甘油氧化酶的摇瓶和10L罐体发酵条件进行研究。确定日 本曲霉生产甘油氧化酶的摇瓶发酵条件为：107个日本曲霉孢子接入已灭菌的装 有100mL发酵培养基的500mL三角瓶中，30℃、180r／min发酵培养24h；10L 罐体发酵条件为：109个孢子接种到灭菌后装有8L发酵培养基的10L发酵罐中， 30℃，风量450L／h，灌压0．03．0．04Mp， 搅拌转速200r／min，发酵培养1 8h。 通过收集菌体，液氮研磨，硫酸铵沉淀，Sephadex G．25凝胶色谱柱脱盐， HiTrap Q HP离子交换层析和琼葡糖G．200 FF凝胶过滤层析对甘油氧化酶进行 了分离纯化，纯化后甘油氧化酶蛋白纯度达98．98％，比活达到38 U／mg。经 SDS．PAGE确定甘油氧化酶单体分子量为66kDa，推测其由六个分子量为66 kDa的亚基组成。 甘油氧化酶在以甘油为底物时，最适作用温度为37℃，温度对酶活力影响 较大，随温度升高酶活力逐渐降低；最适pH为7．0，在pH 9．0．9．5范围内稳定； lmmol／L的Cu2+和C02+对甘油氧化酶活力的促进作用较明显，10mmol／L的 Ca+、C02+、A13+和Mn2+对甘油氧化酶活力的抑制作用较明显；其‰值为 14．34mmol／L，‰为5．93 1 04mmol／L·min～。 关键词：甘油氧化酶，ATMT，发酵，纯化 AbstractAbstract Abstract Abstract Glycerol Oxidase(GLOX)can oxidize glycerol to glyceraldchydes without requirement of all exogeneous cofactor．The enzyme call be employed in a specific colorimetric assay for serum triglycerides，replacing the glycerophosphatase and glycerol kinase．Glycerol Oxidase Call also oxidize ethylene glycol to glyoxal， glycolic acid to glyoxylic acid respectively．Because the reaction catalysed by the enzyme is quicker and has no co-production,the e11zylne will be very useful in industry production． Aspergillus japonicus is a kiIld of filamentous Deuteromycetes that form eonidium．It is known as the important producer of GLOX．To improve enzyme productivity,we firstly constructed a mutant library of Aspergillus japonicus that mediated by Agrobacterium tumefaciens．332 transformants were randomly selected to identi鸟the amount of GLOX mey produced,fortunately,we got four higher glycerol oxidase transforrnants，the mutant Ajyz