扫描电镜与透射电镜样品制作(完全版).docVIP

PAGE PAGE ６ 相关仪器的信息： ? 透射电镜：JEOL(公司) JEM-1230（型号） TEM，产地：日本 ?超薄切片机：Reichert-Jung Ultracut E ultramicrotome，产地：奥地利 扫描电镜：Philips XL30 ESEM，产地：捷克 ? 临界点干燥仪：Hitachi HCP-2 Critical point dryer，产地：日本 ? 真空喷镀仪：Eiko?IB5?ion coater，产地：日本 ? 包埋剂：SPI-CHEM Spurr resin，产地：USA TEM样品包埋块制作有关注意事项 取材： 1、动作迅速：组织离体后，应将其快速放入固定液中，使组织细胞尽可能保持原来的生活状态； 2、减少损伤：选择锋利切割器械，减少牵拉或挤压组织； 3、组织块大小：一般要小于1mm3。 二、固定：固定是指用化学固定剂或一些物理方法迅速杀死细胞 的过程，目的是尽可能保持细胞的原有生活状态，不发生位移，减少组织结构变化。固定剂的主要作用是使蛋白质、脂质等生物大分子发生某种交联。 1、用固定液固定的样品若漂浮在溶液表面，应通过抽真空的方法让样品沉入溶液中 2、使用锇酸的注意事项 I 通风橱中的锇酸溶液为2%的储备液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸盐缓冲液稀释成1%的锇酸溶液。 II 锇酸为剧毒、极易挥发的试剂，必须在通风橱中操作，废液必须收集在密闭容器中。第一次使用锇酸的同学，请务必获得老师或其它熟悉操作人员的指导。 三、漂洗：应彻底漂洗干净，减少固定液与固定液或与脱水剂之间的反应。 四、脱水：脱水是将组织中的游离水彻底清除的过程。由于常用的包埋剂大都是非水溶性树脂，只有将生物组织中的游离水清除干净，包埋剂才能浸入组织。 脱水过程中应注意： I 逐级脱水而不能急剧脱水； II更换溶液时动作要快，特别是不要让组织离开溶液，否则会在组织内外产生气泡； III脱水过程中若要长时间停留或过夜，应放在70%脱水剂中，并在 4℃保存。 五、渗透：渗透就是用包埋剂逐渐取代组织中的脱水剂，使细胞内外 空隙被包埋剂所填充。包埋剂通常由树脂、硬化剂、增塑剂及催化剂4种试剂按一定比例配制而成。 包埋剂配制及使用过程中的注意事项： I 所有容器及玻璃棒等应是清洁和干燥的； II配制过程中应搅拌均匀，使用过程中应避免异物，特别是水、乙醇、丙酮等混入包埋剂； III配制好的包埋剂应密封保存，避免受潮。剩余包埋剂可密封并储存在-10—-20℃冰箱中，延长其使用期。 表1 戊二醛溶液的配制 终浓度 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 5.0 0.2M PBS/ml 50 50 50 50 50 50 50 25%戊二醛水溶液/ml 4 6 8 10 12 16 20 重蒸水加至/ml 100 100 100 100 100 100 100 表2 0.2M磷酸缓冲液（PBS）的配制 A液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液 B液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液 Na2HPO4 28.4g 或Na2HPO4.H2O 31.61g 或Na2HPO4.2H2O 35.6g 或Na2HPO4.7H2O 53.63g 或Na2HPO4.12H2O 71.64g 加双蒸水至1000mL NaH2PO4 24.0g 或NaH2PO4.H2O 27.6g 或NaH2PO4.2H2O 31.21g 加双蒸水至1000mL 按下表比例混合A、B液后，配成0.2mol/L的母液，其中pH7.0为常用配方 pH值 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 A液 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7 B液 92.0 87.7 81.6 73.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 5.30 在缓冲液中加入葡萄糖，蔗糖或氯化钠等均能改变渗透压。 表3 多聚甲醛-戊二醛固定液的配制 溶液名称 剂量 10%多聚甲醛溶液 20ml 0.2MPBS或二砷酸盐缓冲液 50ml 25%戊二醛水溶液 10ml 重蒸水 20ml 表4 2%锇酸溶液的配制 试剂 用量 锇酸/g 1 重蒸水/ml 50 表5 Spurr包埋剂配方 药品名称 硬配方 软配方 我们现用的配方 VCD树脂 10g 10g