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苏云金芽胞杆菌BMB171 基因敲除;T2(2)-ori was a shuttle plasmid for construction of knockout vector for B. licheniformis and B. thuringiensis, with a temperature-sensitive replicon from B. subtilis to promote single crossover in bacterial cells;;1. 载体构建
用于敲除的两个同源臂一般500bp长即可，注意抗生素浓度 Kan 20μg/mL
;2. 重组载体的转化
采用电转化，电压1250V，28度培养，16h左右平板上可以长出转化子，用PCR鉴定阳性转化子。PCR验证时可直接用菌液做PCR模板，煮沸45min，预变性95度10分钟，其他同常规PCR即可。
;U4099和D4097都连接到T2载体上,并且电转化BMB171;3. 单交换的获得
对鉴定的阳性转化子45度划线培养于含Kan的LB平板；挑单菌落接种于含Kan的液体LB中45度培养；对液体培养物45度划线培养于含Kan的LB平板。注意Kan浓度。
;4. 单交换的鉴定
对步骤3所得到的单菌落液体培养，提基因组或者直接用菌液做模板，用鉴定引物（引物一般为一个T2的多克隆位点引物，一个双交换鉴定引物）进行PCR。双交换验证引物：上游鉴定引物设计在上游臂的上游(上游约150bp处设计引物)，下游鉴定引物设计在下游臂的下游(下游约150bp)。;;5. 双交换的获得
将筛选正确的单交换菌落培养于无抗的液体LB中，28度1:1000传代（一般1-2代，最多传6代），后稀释1000倍涂LB平板（注意不能划线），将长出的单菌落对应点钟至LB平板及Kan平板上，28度培养。
;回复突变;;Comparison;Reference
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