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广西科学技术奖申报 1、 项目的名称：电化学生物传感器的制备机理及其应用研究 2、 拟申报奖项：广西自然科学奖 3、 主要完成单位：桂林电子科技大学 4、 主要完成人：陈真诚，韩国成，黄勇，方成，李桂银，梁晋涛，李华。 5、 主要完成人工作贡献： 陈真诚，主要电化学生物传感器的电子传递机理进行研究； 韩国成，主要对C-反应蛋白检测分析； 黄勇，主要对基因点突变进行检测分析； 方 成，主要对总胆固醇、磷酸酶和a-甲胎蛋白进行检测分析； 李桂银，主要对肿瘤标志物进行研究； 梁晋涛，主要对传感器的信号转换进行研究； 李华，主要对传感器的信号放大进行研究。 6、 项目简介： 生物传感器是一种对生物物质敏感并将其浓度转换为电信号进行检测的 仪器。是由固定化的生物敏感材料作识别元件（包括酶、抗体、抗原、微生物、 细胞、组织、核酸等生物活性物质）、适当的理化换能器（如氧电极、光敏管、 场效应管、压电晶体等等）及信号放大装置构成的分析工具或系统。生物传感 器具有接受器与转换器的功能。生物传感器具有体积小、响应快、操作简便、 灵敏度高等优点，可用来研制各种适合病人床边甚至家庭使用的便携式医疗 检测仪。电化学生物传感器是由化学、生物学、物理学、医学、电子技术等 多种学科相互渗透发展起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度髙、分析速 度快、成本低的特点，能在复杂体系中进行在线连续监测，广泛应用于化学、 生命科学、生物医学、环境监测、食品、医药和军事等领域。本项目主要研 究电化学生物传感器构建、机理研究，并用于生物样品分析与检测，分别简 介如下： （1）等位特异性聚合酶链反应联合表面杂交分析技术电化学法检测点突变 基因点突变是指单个碱基改变发生的突变。基因点突变与疾病的关系日 益受到重视，但传统的点突变检测方法因其敏感性低、特异性差和操作复杂而 使点突变的研究受到限制。为此，人们进行了许多新技术的开发和利用，尤其 是PCT-探针技术、荧光能量传递技术(FRET)、新设备和软件技术的有机结 合，使点突变的检测更精、更准、更快。本项目利用等位特异性聚合酶链反应 并联合表面杂交分析技术，发展了一种电化学点突变检测技术。该技术通过 使用一种高保真的、且去除了 3 -5端外切活性的聚合酶一VentRTM核酸聚 合酶。这种酶只有在检测探针与突变型目标链完全匹配的情况下，才能通过 聚合酶链反应使检测探针沿突变型目标链发生延伸，在延伸过程中引入带有 电活性分子标记的碱基，从而产生一种具有氧化还原活性的DNA复制产物。 该产物经加热变性后从目标链上脱离开来并通过分子内杂交来形成特定的发 夹结构。该发夹结构的产物与通过自组装技术固定在金电极表面的捕获探针 杂交后，从而导致DNA复制产物中具有氧化还原活性分子靠近电极表面，产 生电流信号，实现突变位点的识别。当检测探针与野生型目标链配对时，由 于不能完全匹配，导致等位特异性延伸反应不能进行，从而无法通过聚合酶 链反应来形成具有氧化还原活性的DNA复制产物，因而在电极表面检测不到 由氧化还原活性分子产生的电流信号。我们应用该方法成功地区分了 B地中 海贫血症TATA-28(A-G)的野生型与突变型，其检测灵敏度达0. 5 fMo说明 本方法是一种灵敏度髙、特异性好的点突变检测方法。该研究成果发表在 Biosensors and Bioelectronics, 42(2013)526-531 Jl0 C-反应蛋白检测 C-反应蛋白(C-reactive protein, CRP)是一种有效的生物标志物，在 恶性肿瘤、心血管和抑郁症等疾病的早期检测及诊断、病情评估等方面有着 重要的应用，因此其定量检测非常重要。本项目通过自组装的方法可以依次 将L-半胱氨酸、戊二醛、Anti-CRP牢牢的固定在裸金电极的表面，构建电化 学免疫传感器，优化电化学探针，选择蔬基席夫碱镰配合物修饰纳米金作为 检测探针。采用电化学交流阻抗技术，对无标记阻抗型CRP生物免疫传感器 的制备过程和检测过程进行电化学表征，经过ZSimp Win计算软件模拟拟合, 验证所制备的生物免疫传感器表面电子弥散明显，表现出来的阻抗值线性增 加，确定Ab-CRP定量检测分析的工作曲线，从而建立测定Ab-CRP含量的新 方法，该研究成果发表在 Journal of The Electrochemical Society, 161(5) (2014) B75-B80 ±o 总胆固醇、磷酸酶和*甲胎蛋白检测 采用集成式试剂层同时覆盖传感电极和参比电极的方法制作了一次性安 培型总胆固醇生物传感器。集成式试剂层通过丝网印刷形成，试剂层包含胆 固醇酯酶、胆固醇脱氢酶、辅酶、氧化还原媒介体、表面活性剂、稳定剂、 填料和至少一种增稠剂。该传感器对胆固醇乙酸酯的测定范围为50到500 mg/d