第8讲目基因表达及调控.pptVIP

目的基因的表达与调控 基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产的目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。 基因工程技术的核心是基因表达技术。 基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物——蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。 从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。 基因表达在原核生物与真核生物中的差别 真核生物基因表达系统中，转录在核内进行，生成hnRNA，核内加工：剪接内含子和外显子，修饰5’和3’末端后形成成熟mRNA。而后在细胞浆中的核糖体上转译成多肽或蛋白质，再经过加工、糖化、形成高级结构。 本章主要内容 8.1 基因表达的机制 8.2 基因表达的调控元件 8.3 外源基因表达系统 8.3.1 大肠杆菌基因表达系统（重点） 8.3.2 芽孢杆菌表达系统（了解） 8.3.3 链霉菌表达系统（了解） 8.3.4 蓝藻表达系统（了解） 8.3.5 酵母表达系统（自学） 8.3.6 哺乳动物细胞基因表达系统（自学） 8.3.7 植物细胞基因表达系统（自学） 8.4 基因表达产物的检测与分离纯化 8.5 基因工程的争论和安全措施 8.1 基因表达的机制 8.1.1 外源基因的起始转录 8.1.2 mRNA的延伸与稳定 外源基因起始转录后，保持mRNA的有效延伸、终止及稳定存在是外源基因有效表达的关键。 涉及两个问题： 1、要防止因转录物内的衰减和非特异性终止而诱发的 mRNA转录的提前终止； 2、要存在正常的转录终止序列以防止产生不必要的转录产物，使mRNA的长度限制在一定的范围内，从而增加外源基因表达的稳定性。 8.1.3 外源基因mRNA的有效翻译 外源基因mRNA有效翻译必须考虑的基本原则： 不同基因组使用密码子具有选择性。 主密码子（major codon） 8.1.4 表达蛋白在细胞中的稳定性 避免外源基因表达蛋白降解的对策： 8.1.5 目的基因沉默 基因沉默的作用机制 8.2 基因表达的调控元件 8.2.1 启动子 8.2.1.1 原核生物的启动子 转录起始位点：多数细菌启动子转录起始区的序列为CAT，转录从第二个碱基起始，该碱基为嘌呤碱基（A/G）。 原核生物启动子序列特征 示意图（The prokaryotic promoter） RNA聚合酶结合和起始转录的序列 （The sequence of DNA needed for RNA polymerase to bind to the template and accomplish the initiation reaction） 8.2.1.1 真核生物的启动子 Ⅰ型：rRNA 基因启动子 Ⅰ型启动子 所属基因编码的产物为rRNA前体，经剪切加工后成为各种成熟的rRNA分子。 Ⅱ型启动子 转录起始位点 Ⅲ型启动子 内启动子：位于转录起始位点的下游，如 tRNA 和 5SRNA 的启动子。 8.2.1.3 启动子与转录启动 大肠杆菌RNA聚合酶的亚基成分 σ factor: 8.2.1.4 启动子的分离 随机克隆法 8.2.2 增强子 增强子（enhancer）：是能够增强启动子转录活性的DNA顺式作用序列，又称强化子。 8.2.3 终止子 本征终止子：不需要其他蛋白辅助因子便可在特殊的RNA结构区内实现终止作用。 依赖终止信号的终止子：要依赖专一的蛋白质辅助因子。 ①本征终止子 发夹结构(茎环结构)：延缓RNA聚合酶的运动，不终止RNA的合成，但为转录终止创造条件。 寡聚U组成的尾部：转录的终止信号。 ②依赖型终止子 终止位点上游50～90bp区域，是ρ因子的识别位点。 ρ因子依赖型终止子也能形成茎环结构，但茎环的GC含量较低，因此RNA聚合酶在此移动的速度减慢，但停留时间较短，并且茎环结构的下游没有寡聚U结构，RNA聚合酶只能在ρ因子的协助下才能有效终止转录。 在RNA合成起始以后，ρ因子即附着在新生的RNA链上，靠ATP水解产生的能量，沿着5’ -3’方向朝RNA聚合酶移动，到达RNA的3’－OH端后取代了暂停在终止位点上的RNA聚合酶，并从模板和酶上释放RNA，完成转录过程。 终止过程需要消耗能量，所以，ρ因子有终止转录和核苷三磷酸酶两种功能。 8.2.4 衰减子 衰减子（attenuator）：是位于mRNA分子前导序列中的一段控制蛋白质合成起始速率的调节区，亦即发生弱化