分子生物学第二次讨论课.pptVIP

Western blot 、蛋白质双向电泳的原理、方法及在医学中的应用 Western免疫印迹技术 准备工作 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 基本原理 蛋白质是两性电解质，在一定的pH条件下解离而带电荷。当溶液的pH大于蛋白质的等电点(pI)时，蛋白质本身带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH小于蛋白质的等电点时，蛋白质带正电，在电场中将向负极移动 蛋白质在特定电场中移动的速度取决于其本身所带的净电荷的多少、蛋白质颗粒的大小和分子形状、电场强度等 主要原料 10%SDS 30%凝胶贮液（29%ACr-1%Bis） pH8.3Tris-Gly电极缓冲液 tris-HCl（PH6.8）缓冲液 溴酚蓝 等 制作堆积胶后上样 堆积胶凝固后，冲洗玻璃板及电泳槽加电泳缓冲液每个槽 加5ul样品 电泳 接好正负极开始电泳。30ma恒流电泳。 聚丙烯酰胺凝胶是由一定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合而成的三维网状孔结构。 调整双丙烯酰胺用量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分子量的蛋白质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率 如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有大量的负电荷，且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性，特别是在强还原剂如巯基乙醇存在下，蛋白质分子内的二硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋白质分子与SDS充分结合，形成带负电性的蛋白质—SDS复合物；此时，蛋白质分子上所带的负电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，掩盖了不同蛋白质间所带电荷上的差异 由于上层胶的孔径较大，不同大小的蛋白质分子在通过大孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进入小孔胶时，分子量大的蛋白质移动速度减慢，因而在两层凝胶的界面处，样品被压缩成很窄的区带（浓缩效应和分子筛效应） 采用两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris—HCI缓冲液中的Tris用于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离子；CI-是前导离子。在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离子，而在pH＝8.9时，Gly的解离度增加 蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH升高(电泳进行时常超过9．0)，使Gly解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相百分开。 当溴酚蓝跑至分离胶末端时，停止电泳。 完成电泳后，凝胶浸泡于转膜缓冲液中，轻摇20min 除去电泳缓冲液中的盐与去污剂 转膜 按“黑板-纤维垫子-滤纸-胶-膜-滤纸-纤维板子-白板”配好 在膜的反面标字，标上点样孔和分离胶的位置 然后，将转膜夹放入转膜槽中，电泳 对膜进行封闭 降低抗体与膜的非特异性结合 膜泡于封闭液中，4摄氏度摇晃过夜 抗原抗体杂交 一抗稀释后加于膜上，室温1到2小时。洗去一抗后，加入生物素连接的二抗，室温1小时。洗去二抗后，加Avidin-HRP反应。 洗去游离HRP后，立即用ECL化学发光剂进行检测。 HRP在碱性条件下催化发光胺氧化，放出光子 方法之一 应用 检测结核抗体 检测过敏原 蛋白质双向电泳技术 双向电泳简介 2-DE是目前唯一种可以仅通过一次操作解析上千种蛋白质的技术 。 第一向—等点聚焦(IEF) pH梯度载体 pI 第二向—十二烷基硫酸钠(SDS) SDS作为变性剂和助溶剂 分子量 双向电泳具体步骤 样品制备 缓冲液的配制 IPG条重泡涨及上样 第一向：IEF IPG条平衡 平衡缓冲液Ⅰ(还原) 平衡缓冲液Ⅱ(巯烷基化) 第二向：SDS胶条染色 成像及图像分析 为什么要进行样品制备 目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上。 待研究样本(如临床样本)常是各种细胞和组织混杂，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型。 样品制备原则 1 保证样品蛋白质完全溶解，分级效果好，干扰因素少 尽量使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白）。 避免样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。 完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。 尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。 通过超离心去除所有颗粒状物质，防止其堵塞凝胶孔路。 2 最大限度减少样品的损失 低温保存样品(一般需低于-86℃) 尽量缩短处理时间 除盐，省略不必要的过程