一种简单实用快捷凝胶迁移滞后试验.doc

一种基于ODDSEY红外荧光染料的凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）方法介绍 郝玉通 王虚步 杨学森 张伟 余争平 第三军医大学军事预防医学院军事劳动卫生教研室 重庆 400038 提要：本文介绍了一种新的凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）实验方法。利用先进的ODDSEY红外荧光成像系统，把探针进行了红外荧光的标记，优化了EMSA实验的程序以及时间过程，提供了一种更加精确安全有效的EMSA方法 关键词：EMSA；优化；红外 中图分类号： 文献标识码 凝胶迁移滞后实验（electrophoretic mobility shift assays，EMSA）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。该方法可用于检测DNA结合蛋白、RNA结合蛋白，并可通过加入特异性的抗体来检测特定的蛋白质，还可进行未知蛋白的鉴定addin KingyeeNoteReferenceIReferenceIDRefTypeID00002/RefTypeIDTitleThe application of 33P-labeling in the electrophoretic mobility shift assay./TitleSecondTitleBiotechniques JT - BioTechniques/SecondTitlePYear1994/PYearSubAuthor/SubAuthorAuthorWolf SS;Hopley JG;Schweizer M/AuthorSdyAuthor/SdyAuthorVolume16/VolumeNumVolume/NumVolumeIssue4/IssuePages590-2/PagesPubDateApr/PubDatePlacePubUNITED STATES/PlacePubPublisher/PublisherEdition/EditionTypeWork/TypeWork/KingyeeNote[1]。近年来,这项技术被广泛应用于转录分子的实验研究。在以往的实验研究中我们发现,采用化学发光自显影技术的EMSA方法，存在着实验周期长，显影时间不稳定，对实验人员健康有影响等不利因素。因此本实验利用先进的ODDSEY红外荧光成像系统，优化了EMSA实验的程序以及时间过程，提供了一种更加精确安全有效的EMSA方法。 1　材料与方法 1.1细胞核蛋白提取 取约3×106个N9细胞，5 ml 冰PBS冲洗，收集细胞。加入0.25 ml核蛋白提取A液重悬，冰浴15min；加入25μl 1%NP-40，震荡10s；16000×g离心，30s，4℃；将沉淀重悬于50μl 核蛋白提取液（配方中含有二硫苏糖醇和蛋白酶抑制剂）中，震荡10s；置于摇床中冰浴30min，150次/min；再次震荡30s，16000×g离心10min，4℃；取上清即为核蛋白，于‐70℃保存，Lowrry法测定蛋白质浓度。 １.2制胶及预电泳 制5%的聚丙烯酰胺凝胶，在0.5×TBE中预电泳30min。（胶大小：8×8×0.1cm）制胶所用配方如下表： ５×ＴＢＥ 1 ml 双蒸水 6.2 ml 30%聚丙烯酰胺 1.7 ml 甘油 1 ml 10%过硫酸胺 100 μl TEMED 5μl 胶凝后，拔下梳子，用0.5×TBE冲洗胶孔。然后倒满电泳液，用100 V 电压在0.5×TBE电泳液中预电泳30－60min。 1.3配置反应体系（通常在预电泳的同时进行） 本实验的探针序列：STAT3（signal transducer and activator of transcription） Consensus Oligonucleotide1：5’ -- GAT CCT TCT GGG AAT TCC TAG ATC -- 3’，3’ -- CTA GGA AGA CCC TTA AGG ATC TAG -- 5’。按照下表配制反应混合液： 10 X Binding Buffer（100 mM Tris, 500 mM KCl, 10 mM DTT; pH 7.5） 2 μl 25 mM DTT, 2.5% Tween?-20 2 μl Poly (dIdC), 1 μg/μl in 10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.5 1 μl 1% NP