复旦大学生物化学(上)课件(4).pptVIP

多肽链断裂成多个肽段 可采用两种或多种不同的断裂方法(如酶解、化学断裂等）将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 测定每个肽段的氨基酸顺序 肽段的的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法。 一级结构分析的经典三步曲 蛋白质一级结构测定的步骤 1、蛋白质的分离纯化 Purification 2、二硫键的拆分与保护 S-S cleavage blocking 3、(亚基分离） Subunit separation 4、多种方法的部分水解 Partial hydrolysis 5、分离水解后得到的多肽 Peptide separation 6、测序 Sequencing 7、重叠 Overlapping 8、二硫键位置的确定 Disulfide bond po. Cys 容易引起的问题 1、Cys受空气氧化而形成Cys-Cys 2、Cys和Cys-Cys会发生交换反应 3、分析氨基酸组成时，Cys容易受修饰而 不利于定量 4、S-S键使蛋白酶难于作用 5、Edman反应中不能形成稳定的PTH-AA 6、多条肽链以S-S键相连，拥有两个以 上N末端，无法用Edman法测序 N端的测定方法 1、Sanger法 2、Edman法 3、Dansyl chloride/Edman法 4、酶降解法 Edman 降解法(I) DABITC：有色Edman试剂 在Edman试剂上加发色基团 pH 9 CF3COOH/无水 DABITC: 4-N,N-二甲氨基偶氮苯－4－乙内酰硫脲 Edman 降解法(II) 无冕英雄 Pehr Victor Edman 瑞典人, 1916.4.14-1977.3.19 1946-47年在美国留学时想到改进1930 年Abderhalden Brockmann发明的 PITC试剂的反应, 50年发明Edman degradation反应. Acta Chem Scand 4:283 (1950) 1957年移居墨尔本, 远离国际学术中心开始 过隐居生活,1967年研制的自动化仪器可以达到每小时一个氨基酸的速度; 他坚持不申请专利, 给了美国公司得以随便开发仪器的方便。1972年到德国，1977年因脑瘤过世。 由于Edman降解产物需要在紫外域进行检测, 只有HPLC和相应的紫外检测手段进步后才得到普及;60年代后期Moore Stein利用该反应测定了RNase的一级结构, 遗憾的是Edman没有和他们分享Nobel化学奖. 氨基酸的鉴定、分离纯化 PTH-AA Edman降解与DNS-Cl法的结合 ¤ ¤ ¤ 其他序列测定法 Dicarboxypeptidase (DCP) 法 序列 ABCDEFGHIJK--- 酶解 AB，CD，EF，GH，IJ， K－ Edman循环后再酶解 BC，DE，FG，HI，JK，--- 质谱法 质谱法 Edman循环后看分子量的变化 1、肼法 2、3H标记法 3、酶降解法 4、PFPA/PFPAA法 C端的测定方法 蛋白质与无水肼加热 -------NH-CH-CONH-CH-COOH | | Rx Ry -- + -- + NH-CH-CONH-NH2 + NH2-CH-COOH | | Rx Ry 肼(hydrazine)法测定 ＋NH2NH2，100℃，5～10h 溶于有机溶剂而被除去 多种方法确定 蛋白质＋吡啶/ 3H2O /醋酸酐（3:1:3,v/v） 蛋白质C末端Cα原子会被3H