双向凝胶电泳电泳.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * 图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统 试剂 丙烯眈胶凝胶贮备液：取3Og丙烯肮胶(Arc)和0.8g双丙烯眈胶(Bis)溶于双蒸水中，并定容至100mL。过滤后4℃下贮存备用，可保存1-2个月。 10%过硫酸镀：称取过硫酸镀(NH4)2S208(APS)lg，溶于10mL双蒸水中，用前配制1.5mol/L TIts-HCl，pH8.8。 分离胶缓冲液：称取18.15gTIts，用60mL双蒸水溶解，再用4mol/L盐酸调节至pH8.8，然后定容至100mL，4℃保存0.5mol/L TIts-HC1,pH6.8。 试剂 浓缩胶缓冲液：称取6gTIts，用6OmL双蒸水溶解，再用4mol/L 的盐酸调节至pH6.8，然后定容至100mL，4℃保存。 10%SDS溶液：取lOgSDS溶于80mL双蒸水中，并轻缓搅拌(室温低时需水浴溶解)，再定容至100mL，室温存放。 样品缓冲液(样品溶解液)：分别取双蒸水 4mL，0.5mol/LTEts-HC1，pH6.8缓冲液1.OmL，甘油0.80mL，10%(质量浓度)SDS1.6mL，疏基乙醇0.4mL，0.1%(质量浓度)澳盼蓝0.2mL，总体积为8mL，4℃保存。 电极缓冲液：称取3gTIts，14.4g甘氨酸，lgSDS，用水溶解后，定容至1000mL，pH8.3，不必调节。 试剂 染色液：取1g考马斯亮蓝R250，溶于250mL甲醇及100mL冰醋酸中，溶解后定容至100OmL。 脱色液：250mL甲醇(或乙醇)和100mL冰醋酸混匀后，定容至 100OmL。低Mr标准蛋白质混合物(兔磷酸化酶B97400；牛血清白蛋白 667∞；兔肌动蛋白43000；牛碳酸野酶31000；膜蛋白酶抑制剂20300； 鸡蛋清溶菌酶14400)。 蛋白质样品的处理 ⑴ 标准蛋白质样品的处理：取成套的标准蛋白质系列加入20μL样品溶解液，使之充分溶解后置沸水浴中加热3min，取出冷却。 ⑵ 待测蛋白质样品处理：取小牛血清白蛋白0.1mg 及膜蛋白酶0.2mg或其他待测样品(作为未知样品)分别溶解于20-50μL样品溶解液中，置沸水浴中加热3min，取出冷却至室温。 电泳 上槽接负极，下槽接正极，然后打开电源开关立即进行电泳，开始时电流控制在10A，待样品从浓缩胶进入分离胶后，将电流调节至20-25A，在整个电泳过程，电流维持不变，当指示染料澳盼蓝迁移至距下沿1cm左右，即可停止电泳，整个电泳过程约需4h左右。 剥胶与染色 电泳结束后，关闭电源开关，从电泳槽中取下凝胶板并卸下硅胶框，用带细长针头的注射器吸满蒸馏水，将针头插入凝胶与玻板之间，沿玻板缓缓移动，并缓缓将蒸馏水注人，最后注入少量空气，取出针头，将两玻板轻轻揭开后即可取出凝胶板，将之置培养皿中，冲洗胶面后，加入染色液，染色5h或过夜。 染色 结果与分析 ⑴绘制标准曲线 将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及各蛋白质样品区带中心与加样端的距离（cm），如图18-6所示。按下式计算相对迁移率mR： 相对迁移率mR= 蛋白质样品距加样端迁移距离(cm) 溴酚蓝区带中心距加样端距离(cm) 结果与分析 以标准蛋白质的相对迁移率为横坐标，标准蛋白质分子量为纵坐标在半对数坐标纸上作图，可得到一条标准曲线。 根据未知蛋白质样品相对迁移率直接在标准曲线上查出其分子量。 当蛋白质的分子量在15-200kD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。 标准Marker蛋白的电泳图谱 有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。 SDS电泳测定分子量的局限性 不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白