目的基因原核表达载体构建和表达鉴定.pptVIP

4. SDS的注意事项 （1）处理样品时需沸水浴3min左右，以除去蛋白质亚稳态的聚合 （2）PAMF、APS等试剂有一定的神经毒性，需注意生物安全。 （3）灌胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。 * （3）转化温度（42摄氏度）及转化时间一定要控制准确。 （4）转化菌涂布平板时培养时间不能超过16小时，否则抗生素会被消耗掉，未转化菌也会生长。 五、实验意义 使同学们基本掌握基因克隆与表达技术，为进一步的分子生物学研究奠定基础。 克隆出UU基因并表达其蛋白，为后续研究UU的生物学特征奠定基础。 * [1]童伟, 张战军, 贾天军. 肺炎衣原体Cpn0147基因的克隆、表达与定位及其重组蛋白的生物信息学分析[J]. 中国病原生物学杂志, 2009, 8:567-569. [2]李闻文, 贺辉, 肖建华,等. 解脲脲原体四型MB抗原基因的克隆测序及其在大肠埃希菌中的表达[J]. 中华检验医学杂志, 2003, 26(9):567-567. * 六、参考文献 Primer5使用范例 第一步：安装：点击primer v5.exe 第二步：点击激活 在注册机中输入相应的数字并生成验证码，激活软件。 第三步：输入目的序列 filenewDNA sequence，出现如下界面 以UUR8_0011基因为例，序列为3036-3908. atgac atatcatcaa ttagtttatc 3061 aagcacaatt attacttcaa aaaaaccaac gcaacactca agttgctttt gaactattat 3121 atggattaga cgatgaagtt aaagactttt atagtttttc aaacaatcgt ttaaaactag 3181 tagatcttag tttagagtgt aaatattttg aattattaaa tgaatttatt aatgaaaaac 3241 cattagaacg aattttgggc tatggttatt tttgtggaag acgtttttat gttgatgaaa 3301 acgtctttgc ttttcgtgtc gaaactgaat tattagtgga tgttattaat aaaattatta 3361 aacaatcaaa gcatcaaatt aaaagtgtta ttgatgtttg ttgtggtagt ggtgttttag 3421 gattaagtgt aaaaatgaac tttaataatt tagatgtttc attattagat atttctcttg 3481 atgctattag taatagtaaa aaaaacgcac aatatcataa tatagaagga ataaattatc 3541 ttcataaaag catgcaaaaa tactttttac acacaaaaaa acgttttgat ttaattattt 3601 gtaatccacc atatattaaa agtgattatc aattagataa acaagtttta gattatgatc 3661 cccttaatgc attagttgat tttgaacata aagatggaat tagtttttat ttatttataa 3721 taaataatat ttcattaatt tgtaataaaa aattcacgat tgtttttgaa ataggatatg 3781 atcaaaaaac aatcttagaa aatgttctaa aaaaaaatga atttcctatt ttctactact 3841 ttataaatga ttataataat ttatatagaa ttttagtaat aagtaatatt aagtatgaaa 3901 atttatag 将此序列粘贴入空白处。 选择As is，点击ok 第四步：分析酶切位点 点击Enzyme，确定将BamH I和Not I选进右侧位置。然后点击OK 如图示，没有提示BamH I和Not I位置，则此两个内切酶可用。否则更换目的基因。 第五步：设计引物 点击Primer，上游引物点“S” 本实验目的为构建完整的表达载体，需针对目的基因的全部序列，所以上游引物序列与目的基因前部分完全一致，长度等需要自己进行删减（点击Edit primers进行更改） 引物设计需要注意末尾3′端不能选择A，最好选择T 长度25bp以下：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 此处选择的上游引物长度为2