原花青素值的测定.docVIP

3．1 原花青素值的测定 原花青素值的测定采用Bates—smith法和Poaer 法。原理：原花青素在酸性条件下加热转化为红色的花 青素，而儿茶素、表儿茶素等黄烷一3一醇单体没有此反 应(图2)。它们测出的结果是原花青素的相对含量，分 别用原花青素指数和PVU表示，是根据经验公式求得 的。葡萄籽提取物中的原花青素指数一般在80～100之 间，PVU一般在250～350之间。 原花青素值只是相对含量，并非原花青素的真实 含量。据调查，同为原花青素值95的产品，多酚含量相 差15％，质量大相径庭四。很多生产厂家使用原花青素 指数来表示葡萄籽提取物中原花青素的百分含量是错误的。 3．2 原花青素含量的测定 原花青素的含量测定方法很多，也比较混乱。常用 的有以下几种方法。 3．2．1 铁盐催化法 此方法的反应原理与原花青素值测定原理相 同，在计算原花青素的含量时使用了原花青素标准 品。Fe¨、盐酸为常用的催化剂和酸解剂。由于水、乙 醇为反应介质时吸光值很低，一般采用正丁醇为反 应介质【15-161。通常的具体操作：取1．0 mL样液(或原花 青素溶液)于10 mL刻度试管中，加入6．0 mL正丁醇一 浓盐酸(95：5)与2％ 硫酸铁铵溶液(溶解于2 mol／L 盐酸)0．2mL，混匀，置于沸水浴中加热40min后，立即 取出用冰水快速冷却至室温，在550 Nm处测定吸光值。 此方法较简便，而且对原花青素的选择性反应较 好。铁盐催化法对反应体系中的含水量和Fe 浓度要求 比较严格，一般要求含水量6％，Fe 浓度4．5x10 ％， 而且过高的Fe¨浓度对反应没有影响【l51。傅武胜【l61 研究表明3％～4％为合适的含水量，Fe 浓度选择在 9．OxlO ％左右。但是也有学者总结分析2％～6％含 水量对花青素的形成有抑制作用，稍高的Fe¨浓度 (15 g／L)也抑制花青素的生成. 在铁盐催化反应的基础上，杨大进【l I等人利用高 效液相色谱法检测了原花青素含量。该方法将原花青 素在上述铁盐催化条件下生成的深红色花青素离子 进行高效液相色谱分析，从而确定原花青素的含量。 此方法能够排除部分杂质的影响，具有定性定量准确 的优点。 3．2．2 香草醛法 测定原理：原花青素和儿茶素类单体的A环的化 学活性较高，在酸性条件下，其上的问苯二酚或间苯 三酚与香草醛发生缩和，产物在浓酸作用下形成红色 的正碳离子，样品的浓度与产生的颜色呈正相关，在500 llm波长下测定其吸收光值 香草醛法测定时，一般以儿茶素为标准物，以甲醇为溶剂。盐酸、硫酸均可作为反应过程的催化剂，但在 使用硫酸时，浓度不易过高，过高的硫酸易使香草 醛发生自缩合反应和氧化分解 。具体的操作方式 较多：1 mL试液+2．5 mL 1％香草醛甲醇溶液+2．5 mL 25％硫酸或8％盐酸(均溶解于甲醇)，30。【二下反应 15 min～20 min【2l。丑 ；1 mL试液+6 mL 4％香草醛甲醇 溶液+3 mL浓盐酸，室温下反应15 minL231；有的更是在 2O℃下反应15 h[241。操作方式差别较大，不利于使用 者的选择，有待于统一。 3．2_3 紫外分光光度法 原花青素为无色物质，在可见光区无特征吸收峰， 在紫外区有唯一特征吸收峰，最大吸收波长在280 Nm 处。尽管此方法简单快捷，但是此方法只适用于原花青 素含量纯度特别高的产品，不适合一般原料中原花青 素的检测。这是因为儿茶素类在280 Nm处也有最大吸 收，V 、Vc、Ve。、Ve 、芦丁、B一胡萝卜素等物质在此波长 处都有明显的吸收. 3．2．4 Folin—Ciocaheau与HPLC结合法 此方法为美国葡萄籽方法评定委员会推荐使用的 方法。Folin—Ciocaheau法测定的是多酚含量，一般以没 食子酸为对照物。在碱性溶液中，多酚可以将钨钼酸还 原，生成蓝色的化合物，在760 Nm处有最大吸收。葡萄 籽提取物中的多酚含量一般在75％～95％之间。利用 HPLC测定没食子酸、儿茶素、表儿茶素、表儿茶素没 食子酸酯四种单体的含量来代表单体的总量。这是因 为它们四种单体的含量占到了葡萄籽提取物中单体含 量的90．0％以上。原花青素的含量则为多酚含量与单 体含量相减之差。 此方法缺点是蛋白质、氨基酸、核酸、抗坏血酸等 易被氧化的物质也参与Folin—Ciocalteau反应。同时由 于葡萄籽提取物中没食子酸含量甚微(0％～1．2％)，与 儿茶素(1．5％～7．3％)和表儿茶素(2．0％～5．1％)含量 相差悬殊四，原花青素含量用没食子酸量来表示缺乏 代表性。 3．2．5 钼酸铵分光光度法 它是基于邻苯二酚与钼酸铵在弱酸性介质中生成 黄色钼酸酯，反应产物在333 nm波长处具有最大吸收。