王程辉 13301050190 实验设计.docx

细胞与医学遗传学实验设计 王程辉 细胞与医学遗传学实验设计王程辉 一、实验背景： A药物具有保护心肌细胞免受缺血损伤的作用； 心肌细胞缺血过程中B基因的表达产物B蛋白表达量会发生改变。 二：实验目的： 明确B基因的表达产物与心肌细胞缺血间的关系； 明确在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中。 三、实验原理： 1.检测B基因表达产物与缺血间的关系，可能存在的情况时：当心肌细胞缺血时，B蛋白表达量可能增加或减少。其中，B蛋白表达量减少可能由于心肌细胞缺血受损，使B基因表达通路受到抑制。 2.检测A药物与B蛋白的关系时，需要明确两种可能的情况：一是A药物通过B蛋白的作用保护心肌细胞免受缺血损伤；二是A药物作用于B蛋白没有直接因果关系。 3.B蛋白含量的测定：免疫组化法。通过将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，再利用一抗与标记生物素、荧光素等的二抗进行反应，前者再与标记辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AKP）等的抗生物素结合，最后通过显色反应细胞中抗原含量，籍此对细胞内B蛋白量作定性和定量检测。 4.细胞活力的测定：CCK-8比色法。通过在450nm波长处比色，测定吸光度，间接了解细胞活性，判断B蛋白在心肌细胞缺血受损过程中是促进心肌细胞凋亡或是保护心肌细胞。 四、 实验仪器、试剂和材料 1.仪器：显微镜、移液枪、培养基、离心管等 2.主要试剂：PBS、封闭液、一抗、二抗、SABC、DMEM培养液、CCK-8工作液 3.材料：乳鼠心肌细胞 五、实验一：B基因的表达产物与心肌细胞缺血间关系实验 1.新生大鼠原代心肌细胞培养 （1）取新生1~3d乳鼠一只，于无菌条件下取出心脏，用D-Hanks溶液冲洗3次后，剪成1mm3小块。 （2）将心脏碎片转移至离心管中，加5ml左右胰蛋白酶，37°消化5min，自然沉淀，弃上清。再加5ml胶原蛋白酶，37°消化20min，弃上清。 （3）在沉淀中加入2ml培养液，用吸管吹打，将细胞沉淀收集在25cm2培养瓶中，5%CO2饱和湿度，37°培养箱培养1.5h，进行差速贴壁（主要是取出成纤维细胞）。 （4）收集未贴壁的细胞悬液，加入0.1mmol/L Brdu，吹打后接种于35mm培养皿，接种后48h首次换液，继续加入0.1mmol/L Brdu，心肌培养5d。 2.缺血条件下各培养基对照 （1）在5天后，取出4皿培养基。 （2）其中，一皿为空白对照，加入2ml 10%胎牛血清无糖DMEM培养；二到四皿加入2ml不含血清的无糖DEME培养。 （3）二到四皿分别在37°培养箱中培养1h、2h和3h。 细胞模型： 组别 1 2 3 4 缺血条件 无 1h缺血 2h缺血 3h缺血 3.抑制剂条件下各培养基对照 （1）在5天后，取出5皿培养基。 （2）其中，一皿为空白对照，加入2ml 不含血清无糖DMEM培养；二到四皿加入2ml不含血清的无糖DEME和B基因的抑制剂。 （3）二到四皿分别在37°培养箱中培养1h、2h和3h。 细胞模型： 组别 1’ 2’ 3’ 4’ 抑制剂条件 无 1h 2h 3h 4.免疫组化方法测定B蛋白表达量 （1）取上述各培养基各一皿，吸弃培养液，PBS洗3次，甲醇固定5min，PBS洗三次 （2）加入封闭液，37°，30-60min，吸去上清液 （3）加一抗，37°，1-2h后置4°冰箱过夜；PBS洗3次 （4）加二抗，37°，1-2h；PBS洗3次 （5）DAB显色，以蒸馏水终止反应后观察结果 5.CCK-8法测细胞活力 在各组培养基中加入CCK-8工作液，待其作用一小时后，在450nm波长处比色，测定吸光度，OD值即反应细胞活力大小。 6.实验结果分析： （1）在第一个小实验中，若随着缺血时间增加，B蛋白随之增加，可知在心肌细胞缺血条件下，B蛋白参与了心肌细胞缺血损伤。 （2）在第二个小实验中，若随着缺血时间增加，心肌细胞缺血损伤程度比第一个小实验更高，可认为B蛋白具有在损伤下促进心肌细胞凋亡的功能；若损伤程度相比更低，可认为B蛋白具有在损伤下降低心肌细胞凋亡的功能。 （3）将第一个和第二个实验相应组别对比，心肌细胞缺血损伤程度相近，则可认为B蛋白没有参与心肌细胞缺血。 六、实验二：明确在A药物保护心肌细胞免受缺血损伤的过程中，B基因的表达产物是否参与其中 1.设立实验组和对照组： 从原代培养乳鼠心肌细胞培养基中取8皿，均加入2ml不含血清无糖DEME培养，进行1h缺血处理后，做如下处理： 组别 对照组 药物组 抑制组 药物+抑制组 A药物 无 有 无 有 抑制剂 无 无 有 有 2.免疫组化方法