第二章工具酶修改自制.pptVIP

一、工具酶 限制性核酸内切酶 T4DNA连接酶 DNA聚合酶（Taq 酶） 逆转录酶 核酸酶 末端转移酶 3、有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多种单一酶 切位点，称为多克隆位点； 4、分子量小，有较大的外源DNA装载能力。 5、细胞内稳定性高。 （三）分类 1、按照用途分： 一般克隆载体、表达载体、建库载体、T或U载体 ...... 2、按构建克隆载体的材料来源分: 质粒克隆载体、病毒（噬菌体）克隆载体、线粒体克 隆载体、人工染色体克隆载体、叶绿体克隆载体 ...... B质粒载体的一般结构 3、按克隆载体的受体生物分: 1）原核生物克隆载体 大肠杆菌克隆载体、放线菌克隆载体 ...... 2）真核生物克隆载体 酵母克隆载体、植物克隆载体、动物克隆载体 、人克隆载体...... （四）常用载体 质粒DNA、噬菌体或病毒DNA、染色体定位整合载体、人工染色体克隆载体（YAC、BAC）等。 1 质粒克隆载体（plasmid） （1）大肠杆菌质粒载体 质粒是自然存在于细菌细胞中，独立于染色体外可以自主复制的一段裸露的环状DNA分子（超螺旋）。在宿主细胞中有相对稳定的拷贝数。 A、质粒的类型（复制方式）： 松弛型质粒和严紧型质粒 ① 严紧型质粒 复制与宿主染色体同步，并与宿主蛋白质合成有关，与DNA聚合酶 I 活性无关，蛋白质合成停止，质粒与宿主染色体复制亦停止，因此每个宿主中质粒拷贝数只能达到1到数个（低拷贝质粒）。 ② 松弛型质粒 复制与宿主染色体不同步，与宿主蛋白质合成无关，与DNA聚合酶 I 活性有关，蛋白质合成停止，质粒仍可复制，因此每个宿主中质粒拷贝数可达到10-206个。若需提取质粒，用氯霉素处理宿主，抑制蛋白质合成及细菌染色体复制，质粒的拷贝数可达数千个。（高拷贝质粒） 一般选用松弛型复制控制质粒作为基因工程载体。 质粒载体含有质粒的复制起始点，可按质粒复制形式进行复制 目 录 大肠杆菌质粒载体pBR322简图 主要用于基因克隆，可克隆10kb以下的外源DNA片段 四环素抗性基因 常用质粒载体pUC系列 （2）农杆菌Ti质粒载体 致癌农杆菌的内源质粒，与植物接触时可引发其产生冠瘿瘤，称Ti质粒（Tumor inducing plasmid）。双链环状，约200kb ，可进入植物的部分约25kb，称T-DNA。其左右两边界的正向重复序列（LTS和RTS）对T-DNA的转移和整合是必需的。保留这两个序列而构建的含LB和RB的质粒载体，可携带外源DNA转移整合至植物基因组。主要通过使用基因枪用于植物基因转移。 农杆菌Ti质粒载体图谱 载体中LB和RB部分是T-DNA的转移和整合进入植物细胞所必需的。 Ti质粒重组过程 （3） 蓝藻穿梭质粒 含有大肠杆菌质粒载体的必备元件和蓝藻质粒的复制起始位点。可在转化的大肠杆菌和蓝藻中复制。 （4） T-克隆载体和U-克隆载体 PCR反应时，终延伸30min左右，Taq酶可在所有PCR产物的3’端加上一个多聚腺苷酸的尾巴（polyA尾）。5’端带有polyT的线性载体（T载体）可与PCR产物以TA配对的方式直接进行克隆，即TA克隆（A-T）。由于T易与其他碱基发生非特异性配对，就有了U载体的产生（A-U）。 pGEM-T Easy Vector 图谱 病毒颗粒（DNA或RNA+外壳蛋白）可感染宿主细胞，并利用其合成系统进行DNA或RNA的复制及壳蛋白的合成，并进行组装从而实现增殖。专门感染细菌的病毒称噬菌体。 （1）λ噬菌体克隆载体 由λDNA和外壳蛋白组成。是一种可在体外包装的细菌病毒，可高效感染大肠杆菌。λ-噬菌体DNA是线状双链DNA分子， 全长约50kb，每条链各带12bp长的单链互补粘性末端（COS序列）。进入宿主细胞后不久，COS序列碱基配对，形成环状DNA分子。 2. 病毒（噬菌体）克隆载体 噬菌体结构图 * 目 录 * 目 录 第二部分 重组DNA技术的基本条件 涉及内容： 1 工具酶 （1）限制性内切酶 （2）DNA连接酶 （3）DNA聚合酶 2 载体 （1）载体的功能及特征 （2）质粒 （3）噬菌体 （4）人工染色体 3 受体菌或受体细胞 重组DNA技术中常用的工具酶 切除末端磷酸基 碱性磷酸酶 在3′羟基末端进行同质多聚物加尾 末端转移酶 降解相应的DNA或RNA 核酸酶 合成cDNA 替代DNA聚合酶I进行填