免疫学检测和相关实验技术.ppt

免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。 ?免疫学技术的应用极为广泛, 疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。 第一节 免疫学检测原理 细胞水平检测 分子水平检测 基因水平检测 一、免疫细胞的检测 对机体参与免疫应答的细胞进行分离、纯化、鉴定、计数及功能测定。 (一) 免疫细胞分离与纯化 (二) 免疫细胞功能测定 1. T细胞功能测定 (1) 细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。 * 丝裂原主要有PHA、Con A和PWM； * 抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等； * 同种MHC及抗CD3单抗等 * 肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养 2. B细胞功能测定 (1) B细胞增殖(转化)试验 (2) 溶血空斑形成试验 (3) 反向溶血空斑试验 (4) 酶联免疫斑点法(ELISPOT): 一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。 3. NK细胞活性测定 (1)形态学检查法 (2)放射性核素释放法： 用放射性核素(51Cr、125I －UdR)标记靶细胞 (3)酶释放法： 测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性 (4)化学发光法 (5)流式细胞术 4．吞噬细胞功能测定 (1)中性粒细胞趋化功能测定 滤膜渗透法(Boyden小室法) (2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定 1) 显微镜检法 2) NBT试验 3) 化学发光测定法 (3) 巨噬细胞吞噬功能测定 (4) 巨噬细胞细胞毒测定 二、免疫分子的检测 免疫球蛋白的测定 补体测定 细胞因子及其受体检测 黏附分子的检测 细胞因子及其受体的检测 生物学测定法 免疫学检测法 分子生物学测定法 细胞因子受体检测的基本技术 根据细胞因子对特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平, 一般以活性单位(U/ml)表示。 1、促进细胞增殖和增殖抑制法 3H-TdR掺入法、 比色法（ MTT、WST-1） 染色法 直接计数法 2、细胞毒活性测定法 51Cr释放 比色法（ MTT、WST-1） 3、集落形成法 4、细胞病变抑制法 5、趋化活性测定法 免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品(如脑脊液)可用免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)进行检测。 分子生物学测定法 RNA印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、PCR和Real Time PCR等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。 CKR检测的基本技术 细胞因子的广泛生物学活性是通过与各自相应的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。 粘附分子的检测 某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。粘附分子的检测方法目前大多采用免疫学技术检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。 三、免疫相关基因检测 * 包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑点杂交、原位杂交等以及PCR技术等。 * 杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用放射性核素或其他标记物(生物素、荧光素、地高辛等)标记，并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。分为cDNA探针、寡核苷酸探针、基因组DNA探针及RNA探针等。 ㈠细胞因子基因组DNA或mRNA的检测 1. Northern杂交分析 2. 斑点及狭缝印迹杂交: 将DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上再进行杂交 3. 原位杂交法 4. PCR扩增产物杂交分析：将细胞因子的mRNA经过逆转录为cDNA，用特异性细胞因子引物进行PCR扩增，通过Southern blot后，再用标记探针检测特异细胞因子DNA的水平。 5．Southern印迹杂交 ㈡BCR及TCR克隆性基因重排分析 1．Southern印迹杂交法： 仅适用于科研，而不适用于临床诊断。 2. PCR扩增技术: ㈢HLA基因分型技术 1．序列特异性寡核苷酸探针PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA-Ⅱ类抗原分型方法，能鉴定所有已知序