羽衣甘蓝ARC1蛋白的原核表达纯化及泛素连接酶活性分析-园艺学报.pdf

园 艺 学 报 2013 ，40 （12）：2472 –2478 http: // www. ahs. ac. cn Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com 羽衣甘蓝 ARC1 蛋白的原核表达、纯化及泛素 连接酶活性分析 蓝兴国，李晓屿，杨 佳，李玉花* （东北林业大学生命科学学院，哈尔滨 150040 ） 摘 要：ARC1 是植物特有的一类含有 U-box/ARM 结构域的蛋白，在芸薹属植物自交不亲和 （self-incompatibility ，SI ）信号转导中起着正向调控因子的作用。将羽衣甘蓝（Brassica oleracea var. acephala ）BoARC1 编码区的序列连接到原核表达载体pET-14b 上，通过酶切鉴定和测序分析，构建pET-14b- BoARC1 表达质粒；将获得的阳性表达质粒转化到大肠杆菌表达菌株 BL21 （DE3 ）pLysS 中，利用IPTG 进行诱导表达。SDS结果显示，在分子量 69 kD 处有BoARC1 蛋白特异性地诱导表达；利用Ni2+-NTA 树脂通过亲和层析的方法获得 BoARC1 融合蛋白。在泛素激活酶（E1 ）、泛素结合酶UBC7 （E2 ）和泛素 体外泛素化反应后，通过免疫印迹的方法检测，显示出 BoARC1 融合蛋白能够将底物进行多泛素化修饰； 当U-box 中保守位点第 323 位 Pro 突变为 Ala 或其他泛素化组分缺少时，底物不能被泛素化修饰。 关键词：羽衣甘蓝；自交不亲和性；ARC1 ；原核表达；泛素连接酶 中图分类号：S 681.9 文献标志码：A 文章编号：0513-353X （2013 ）12-2472-07 Prokaryotic Expression，Purification and in Vitro Ubiquitination Assay of BoARC1 from Ornamental Kale * LAN Xing-guo ，LI Xiao-yu ，YANG Jia ，and LI Yu-hua （College of Life Sciences，Northeast Forestry University ，Harbin 150040 ，China ） Abstract ：ARC1 ，which belonging to the plant-specific U-box/ARM protein ，acts as a positive mediator of self-incompatibility signaling in Brassica . Here，the BoARC1 coding region sequence was amplified and inserted into the prokaryotic expression vector pET-14b. The pET-14b-BoARC1 constructs were confirmed by the double restriction enzyme and sequencing analysis. The E. coli BL21 （DE3 ）pLysS cell was transformed pET-14b-BoARC1. SDSresults showed that the recombinant BoARC1 fusion