细胞器蛋白的制备.ppt

LOGO LOGO 细胞与细胞器蛋白的制备 细胞与细胞器蛋白质的制备 细胞与细胞器蛋白质的提取 蛋白质纯化 细胞及细胞器蛋白质的提取 意义： 在研究细胞时经常要研究细胞的不同组份，而研究得最多的细胞组份就是细胞核、线粒体和细胞浆。 分离细胞核、线粒体和细胞浆蛋白，不仅可以用于研究蛋白在细胞内的定位，而且很多时候分离出来的蛋白可以用于细胞信号转导通路方面的研究。 细胞及细胞器蛋白质的提取 1.细胞核蛋白质的提取 2.线粒体及细胞浆蛋白质的提取 3.全细胞蛋白质的提取 细胞及细胞器蛋白的提取 1.细胞核蛋白质的提取 （1）取对数生长的HeLa细胞计数，按1.6×106 个细胞接种于100mm培养皿中，培养适当时间； （2）收取细胞与培养液至离心桶中，4℃、3000 rpm/min 离心5分钟，弃上清； （3） 用1 ml 预冷的PBS重悬细胞沉淀，并将其移入预冷的EP管，离心升至12000rpm/min即停止，弃上清； （4）细胞沉淀用homogenization buffer重悬； （5）使用Dounce homogenizer对细胞重悬液进行homogenize，操作次数视细胞株与操作人而定； （6）4℃、1000/min 离心5分钟，弃上清，沉淀即为细胞核； （7）向细胞核沉淀中加入适量裂解液RIPA，充分混匀，冰上孵育1小时，每隔15分钟混匀一次； （8）4℃、12000 rpm/min 离心15分钟，弃沉淀，将上清移入新的预冷EP管； （9）取细胞核蛋白质进行BCA定量； （10）取等量细胞核蛋白质进行SDS电泳分析。 2.线粒体及细胞浆蛋白质的提取 （1）取对数生长的HeLa细胞计数，按1.6×106 个细胞接种于100mm培养皿中，培养适当时间； （2）收取细胞与培养液至离心桶中，4℃、3000 rpm/min 离心5分钟，弃上清； （3）用1 ml 预冷的PBS重悬细胞沉淀，并将其移入预冷的EP管，离心升至12000 rpm/min即停止，弃上清； （4）向细胞沉淀中加入91μl/管 Mitochondria Isolation Kit试剂A（含蛋白酶抑制剂），中速旋涡震荡5秒钟，冰上孵育2分钟； （5）接着加入10μl/管 Mitochondria Isolation Kit试剂B（含蛋白酶抑制剂），高速旋涡震荡5秒钟，冰上孵育5分钟； （6）再加入100μl/管 Mitochondria Isolation Kit试剂C（含蛋白酶抑制剂），颠倒混匀，4℃、700g离心10分钟，弃沉淀； 2.线粒体及细胞浆蛋白质的提取 （7）将上清移入新的预冷EP管，4℃、12,000g/min离心15分钟，沉淀含线粒体，将上清移入另一新的预冷EP管，再一次4℃、12,000g/min离心60分钟或4℃、100,000g/min离心15分钟，上清即含胞浆蛋白质； （8）向含线粒体沉淀中加入60l/管 Mitochondria Isolation Kit试剂C（含蛋白酶抑制剂），混匀清洗沉淀，4℃、12,000g离心10分钟，弃上清； （9）向沉淀中加入适量细胞裂解液RIPA，充分混匀，冰上孵育1小时，每隔15分钟混匀一次； （10）4℃、12000 rpm/min 离心15分钟，弃沉淀，将上清（即含线粒体提取物蛋白质）移入新的预冷EP管； （11）取胞浆蛋白质和线粒体蛋白质进行BCA定量； （12）取等量蛋白质的胞浆和线粒体样品进行SDS电泳。 3.全细胞蛋白质的提取 （1）取对数生长的HeLa细胞计数，按1.6×106个细胞接种于100mm培养皿中，培养适当时间； （2）收取细胞与培养液至离心桶中，4℃、3000 rpm/min 离心5分钟，弃上清； （3）用1 ml 预冷的PBS重悬细胞沉淀，并将其移入预冷的EP管，离心升至12000 rpm/min即停止，弃上清； （4）向细胞沉淀中加入适量的细胞裂解液RIPA或IP，充分混匀，冰上孵育1小时，每隔15分钟混匀一次； （5）4℃，12000 r/min离心15分钟，上清转移至新的EP管中，采用BCA蛋白定量试剂测定蛋白质浓度留待其他实验。 注意事项 1.抽提蛋白的所有步骤都需在冰上或4℃进行。 2.所有试剂及器具均需预冷后使用，以保证蛋白质的完整性及活性。 蛋白质纯化 意义： 随着分子生物学的发展，越来越多的科研人员熟练掌握了分子生物学的各种实验技术，并研制成套试剂盒，使基因克隆表达变得越来越容易。但分子生物学上游的工作往往并非最终目的，分子克隆与表达往往是要拿到纯的表达产物，以研究其生物学作用，或者大量生产出可用于疾病治疗的生物制品。 蛋白质纯化的一般原则 主要将目