细胞工程--C5-细胞融合和单克隆抗体.pptVIP

单抗的标记 1. 酶标记 （1）辣根过氧化物酶（HRP）标记。 （2）碱性磷酸酶（AP）标记。 （3）PAP、APAAP的制备。 何化学交联剂处理酶和抗体，它们的活性均不受化学因素的影响，提高了敏感性和特异性。PAP和APAAP试剂的制备方法常采用先将HRP或AP加入抗HRP或AP的抗血清或单抗中而获得免疫沉淀物，再加入酶盐水，过量的酶有助于免疫沉淀物的解离反应，调pH至2.3，随后立即中和，除去不溶解的 单抗的标记 1. 酶标记 （1）辣根过氧化物酶（HRP）标记。 （2）碱性磷酸酶（AP）标记。 （3）PAP、APAAP的制备。 沉淀物后，加入半饱和硫酸铵，纯化PAP或APAAP。根据需要还可将PAP和APAAP试剂先与相应桥抗体结合后，再与特定单抗组成完整的诊断试剂，这样，单抗即可一步法用于诊断或检测试验等。 单抗的标记 1. 酶标记 2. 荧光素标记 （1）异硫氰酸荧光素（FITC）标记。FITC标记抗体的原理是在碱性条件下，FITC的异硫氰基能与IgG的自由氨基结合，形成IgG与荧光素的结合物。FITC是最常用的荧光素，其次选用TRITC（四甲基异硫氰酸罗丹明）。 （2）异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记。 单抗的标记 1. 酶标记 2. 荧光素标记 3. 同位素标记 4. 生物素标记 生物素标记反应常用生物素琥珀酰亚胺酯进行。生物素是与抗体分子的游离赖氨酸等发生偶联反应而完成标记。 5. 其他标记技术 适用于蛋白质的其他标记方法也可用于单抗，如胶体金标记、化学发光标记、SPA标记、铁蛋白标记等。 单克隆抗体生产的影响因素、失败原因分析 由于制备McAb的实验周期短，环节多，所以影响因素就比较多，稍不注意就会造成失败。 其主要失败原因和影响因素有： 1. 污染 包括细菌、霉菌和支原体的污染，这是杂交瘤工作中最棘手的问题。一旦发现有霉菌污染就应及早将污染板弃之，以免污染整个培养环境。支原体的污染主要来源于牛血清，此外，其他添加剂、实验室工作人员及环境也可能造成支原体污染。在有条件的实验室，要对每一批小牛血清和长期传代培养的 单克隆抗体生产的影响因素、失败原因分析 1. 污染 细胞系进行支原体的检查，查出污染源应及时采取措施处理。对于污染的杂交瘤细胞可以采用生物学的过滤方法，将污染的杂交瘤细胞注射于BALB/c小鼠的腹腔，待长出腹水或实体瘤时，将之取出并分离杂交瘤细胞，一般可除去支原体污染。 2. 融合后杂交瘤不生长 单克隆抗体生产的影响因素、失败原因分析 1. 污染 2. 融合后杂交瘤不生长 在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑以下因素： （1）PEG有毒性或作用时间过长 （2）牛血清的质量太差，用钱没有进行严格的筛选。 （3）骨髓瘤细胞污染了支原体。 （4）HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。 单克隆抗体生产的影响因素、失败原因分析、 1. 污染 2. 融合后杂交瘤不生长 3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 （1）融合后有细胞生长，但无抗体产生，可能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。 （2）有可能是免疫原抗原性弱，免疫效果不好。 （3）对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染色体丢失。 单克隆抗体生产的影响因素、失败原因分析 Goding(1982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。 三要： 要大量保持和补充液氮冻存的细胞原管。 要应用倒置显微镜经常检查细胞的生长状况。 要定期进行再克隆。 三不要： 单克隆抗体生产的影响因素、失败原因分析 Goding(1982)曾提出“三要”“三不要”，可能是防止抗体停止分泌的有效措施。 三要： 三不要： 不要让细胞“过度生长”。因为非分泌的杂交瘤细胞将成为优势，压倒分泌抗体的杂交瘤细胞。 不要让培养物不加检查地任其连续培养几周或几个月。 不要不经克隆化而使杂交瘤在机体内以肿瘤生长形式连续传好几代。 单克隆抗体生产的影响因素、失败原因分析 1. 污染 2. 融合后杂交瘤不生长 3. 杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 4. 杂交瘤细胞难以克隆化 可能于小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。 * 酶联免疫技术（ELISA） （6）ABS-ELISA法。 成。生物素为小分子化合物，分子质量244。用化学方法制成的衍生物素-羟基琥珀酰亚胺酯可与蛋白质和糖等多种类型的大小非分子形成生物素标记产物，标记方法颇为简便。生物素与亲和素的结合具有很强的特异性，其亲和力较抗原抗体反应大