核酸的结构和性质.ppt

★变性因素： 热变性 酸碱变性(pH4或11) 变性剂(尿素/盐酸胍/甲醛) ★变性后的理化性质： 260nm吸收值升高。 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 1 OD260 ds DNA 50 ?g ss DNA 37 ?g RNA 40 ?g Hyperchromic effect 增色效应 ★DNA的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 解链温度(Tm):DNA的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 浓度50ug/mL时，双链DNA A260=1.00，完全变性（单链），A260= 1.37。当A260增加到最大增大值一半时，即1.185时，对应的温度即为Tm。 DNA的Tm一般在82～95℃之间。 影响DNA的Tm值的因素 ①DNA均一性。 均一性高，变性的温度范围越窄，据此可分析DNA的均一性。 ②G-C含量与Tm值成正比。测定Tm，可推知G-C含量。 G-C% =（Tm-69.3）×2.44 影响DNA的Tm值的因素 ③介质中离子强度。离子强度高，Tm高。 影响DNA的Tm值的因素 3.4.2 复性 变性DNA在适当（一般低于Tm20～25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。 ★复性机制：10～20bp成拉链 ★热变性DNA在缓慢冷却时可以复性，快速冷却不能复性。 ★DNA片段越大，复性越慢； ★DNA浓度越大，复性越快。 ★复性速度可用Co·t衡量。 Co为变性DNA原始浓度mol·L-1， t为时间，以秒表示。 DNA浓度与复性时间的关系 T1/2 × C ＝ const DNA复性与Cot分析 ●1个核苷酸对（A.U），若浓度为Co=1.0mmol/L，则 50%复性时， Cot1/2=4×10-6mol.s/L，t=0.004秒 全部复性， Cot=10-4， t=0.1秒 ●E.coli 4.2×106碱基对，若浓度Co=1.0 umol/L，则 复性50%， Cot1/2=10 mol.s/L，t=107秒，约115天。 复性100%，Cot=500 mol.s/L，t=5×108秒，5758天。 ●根据复性动力学可以测定基因组的大小和重复序列的拷贝数 Cot曲线的另一种表达形式 人DNA的Cot曲线 哺乳动物的DNA 一般均呈右图的曲线，这是因为它们的基因组DNA 中插入了大量的重复序列，如人的DNA中就插入了长度为350bp的Alu序列达50万份拷贝之多。 3.4.3 分子杂交 分子杂交的原理示意图 不同来源的DNA单链间或单链DNA与RNA之间只要有碱基配对的区域，在复性时可形成局部双螺旋区，称核酸分子杂交（hybridization）。 制备特定的探针(probe)通过杂交技术可进行基因的检测和定位研究。 实例：southern印迹法 1、Southern Blotting DNA样品 → 酶切 → 电泳 → 碱变性 → 转膜 → 固定 → 杂交 → 洗涤 → 放射自显影 变性（NaOH 0.5mol/L） 转膜（NC膜，尼龙膜） 固定（80℃，4-6h） 杂交（高盐浓度，68℃，几小时） Southern Blotting可用于DNA之间同源性分析，确定特异性DNA序列的大小和定位。 2、Northern Blotting 研究对象是mRNA，探针一般是DNA。 总RNA或mRNA需在变性条件下电泳（乙二醛、甲醛） 3、Western Blotting 抗原与抗体的杂交。 研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 * 1.病毒 噬菌体T2结构 头部 颈圈 尾部 基板 尾丝 尖钉 动物病毒切面模式图 被膜（脂蛋白、碳水化合物） 衣壳（蛋白质） 核酸 突起（糖蛋白） 病毒粒 细菌拟核（nucleoid）的突环结构 DNA-蛋白质核心 突环由双链DNA结合碱性蛋白质组成 平均一个突环含有约40kpDNA 2.细菌的拟核 3.真核生物的染色体 核小体（组蛋白核心 + DNA） 真核生物染色体DNA组装不同层次的结构 DNA(2nm) 核小体链( 11nm,每个核小体200bp) 纤丝(30nm,每圈6个核小体) 突环( 150nm,每个突环大约75000bp) 玫瑰花结( 300nm, 6个突环) 螺旋圈( 700nm,每圈30个玫瑰花) 染色体( 1400nm,每个染色体含10个螺旋圈) 2.4 RNA的结构 2.4.1 RNA的一级结构 AMP、GMP、CMP、UMP通过3’、5’磷酸二酯键形成的线形多聚体。 ①组成RNA的戊糖是核糖 ②RNA的U替代DNA中的T，此外，RNA中常有一些稀有碱基。