细胞生物学实验细胞培养基本理论及技术 课件.ppt

4.细胞DNA 合成测定法 3 H-TdR 掺入法 基本原理： 胸腺嘧啶核苷( TdR) 是DNA 特有的碱基，也是DNA 合成的必需物质。 用核素3 H 标记TdR 即3 H-T dR 作为DNA 合成的前体能掺入DNA 合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA 的代谢及细胞增殖情况。 流式细胞仪测定DNA 合成 测定细胞增殖周期和DNA 合成 细胞培养常用的操作技术 细胞接种 细胞传代和换液 细胞冻存 细胞复苏 1.细胞接种 细胞培养瓶：T25 、 T75 、 T150 培养板：96、 24、 12、 6孔 培养皿: 直径为35，55，60，70，90，150mm 细胞接种时浓度要稍大一些，血清浓度为10%~20%。在起始的2天中尽量减少振荡，以防止刚贴壁的细胞发生脱落，漂浮。 2.细胞传代和换液 体外培养的细胞生存在培养瓶、培养皿的培养液中，生存空间和营养物质都是有限的，当其生长增殖达到-定密度后，需要分离出-部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代。 细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏，代谢产物增多，pH变为酸性等不适宜细胞生长的因素，但细胞还未生长达到饱和浓度，又仍需继续培养，常采取更新营养液方式来更新营养成分以满足细胞继续生长和繁殖的需要，这一过程叫换液。 贴附细胞长满瓶底80%应及时传代。 悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密时应及时传代。 所有细胞培养液变黄时应及时换液。 贴壁细胞的传代 贴壁细胞的传代 应先吸(倒)尽培养基,吸的越干净越好,以免中和后加入的消化液,使强度减弱； 根据不同细胞贴壁程度加入消化液进行消化, 晃动使消化液铺均匀，培养箱放置,镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后,轻轻振动瓶底使细胞全部脱落； 加入2-3ml完全培养基后,轻轻吹打,使细胞基本成单个悬浮; 分置其它无菌培养瓶内,加入培养基后继续培养。??????? 悬浮细胞的传代 一般传代可直接将细胞原液分置其它培养瓶内,加入完全培养基继续培养; 如要高浓度可先低速离心（500-1000rpm,5min）后加入培养基,轻轻吹匀后,分置其它培养瓶内加入完全培养基继续培养。 贴壁细胞的换液： 方法比较简单，即弃去旧液，加入与原培养液相同的等量完全培养基。 悬浮细胞的换液： 非离心法：将原培养瓶竖起，在 30 min 内，若细胞沉于瓶底，可用吸管轻轻吸弃一半原上清，再加入等量的新鲜完全培养基（半量换液）。 离心法：吸出细胞悬液，采用低速离心（500-1000 rpm，5-10min），弃去（一半）上清加入等量的新鲜完全培养基，混匀后再转入原瓶继续培养。 3.细胞冻存 冻存原理： 细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，冰晶体积膨胀造成细胞核 DNA 空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。 常用的细胞低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，与慢冻方法结合，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。 常用几种普通培养基冻存液： 包含10％二甲基亚砜（DMSO）的完全培养基， 包含10％二甲基亚砜（DMSO）的血清， 50％ 细胞条件培养基和50％含有10％二甲基亚砜的新鲜培养基。 50％ 细胞条件无血清培养基和50％包含有7.5％二甲基亚砜的新鲜的无血清培养基。 包含有7.5％二甲基亚砜和10％细胞培养级BSA的新鲜无血清培养基。 细胞冻存操作步骤： 1）配置冻存液：在小牛血清（或完全培养基）中逐滴加入 DMSO，使其终浓度达到 10%，用枪吹打均匀。 2）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。 贴壁细胞：去掉细胞培养液，胰蛋白酶消化，使其成为均匀分 散的细胞悬液，将细胞收集于离心管中离心(1000 r/ min，10 min )。 悬浮生长的细胞：直接将细胞收集于离心管中离心(1 000 r/ min， 10 min )。 3）弃上清，加入适量冻存液，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为2×106～5×106/mL 之间。 4）将上述细胞悬液分装于冻存管中，冷冻管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。 5）进行程序性降温，并根据不同目的冻存保存。 冻存基本原则： 慢 冻（ 程序性逐级冷冻） 控制降温速度：程序性降温盒，-80 ℃放置， -1℃ /min 人工法：4 ℃冰箱中2～3 h - 20 ℃内3～4 h -80 ℃过夜冷冻（如果细胞近期内