感受态细胞的制备与重组子的筛选.ppt

感受态细胞的制备和转化及重组质粒的筛选 1、掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 2、熟悉实验的操作具体步骤，掌握无菌操作技术 3、掌握蓝白斑筛选重组质粒转化的原理 实验目的 实验原理与方法 冷CaCl2转化原理： 受体细胞处于0℃、CaCl2低渗溶液处理后，细胞膨胀呈球形，细胞膜的通透性发生改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞( Competent cells )，外源DNA吸附于细胞表面，经42 ℃短时间热击处理，促使细胞DNA复合物进入细胞。 进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞)。 冷CaCl2转化过程： 转化（transformation）是质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 （1）吸附 双链DNA吸附于受体菌表面。 （2）转入 双链DNA分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解。 （3）自稳 外源质粒DNA分子在细胞内复制成双链。 （4）表达 体外基因随同复制子同时复制，分裂，转录翻译。 体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制和表达。 外源基因获取（PCR扩增） 克隆到载体（T载体） 阴性（无外源基因插入） 阳性（插入外源基因） 转化 阳性菌株 插入阴性克隆（蓝色菌落） 插入阳性克隆（白色菌落） RNA提取 逆转录 cDNA模板 （1）抗生素筛选法 质粒携带有选择性抗生素基因（如氨苄青霉素等），可使接受了该质粒的受体菌具有了氨苄青霉素抗性，将经过转化后的受体细胞经过适当稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化子才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素而无法存活。 重组子的筛选 （2）互补法 蓝白斑筛选（IPTG-Xgal）试验： 野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。 细菌染色体 含有lacZ基因C端序列 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株 LacZ’基因 多克隆位点 β-半乳糖苷酶启动子 IPTG 非代谢性的乳糖启动子诱导剂 激活 载体 生成 含有X-gal和IPTG的培养基 有活性的 β-半乳糖苷酶 细菌染色体 含有lacZ基因C端序列 有活性的 β-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷酶缺陷型菌株 插入片段到多克隆位点 lacZ‘基因被破坏 载体 无法生成 含有X-gal和IPTG的培养基 pUC18载体上带有氨苄青霉素抗性基因（Ampicillin resistance gene）和lacZ’基因。 氨苄青霉素抗性基因能够区分出转化子（携带有pUC18载体的受体菌）和非转化子。 蓝白斑筛选则能在转化子的基础上区分空载体和连接成功的载体（连接上SOD基因的pUC18载体）。 操作步骤 1）感受态细胞的制备(CaCl2法) 从LB平板上挑取新活化的E.coli单菌落。接种于3-5ml LB液体培养集中，37℃下振荡培养12h左右，直至对数生长后期； 再将该菌悬液以1：100的比例接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养至OD600 达0.5左右； 取培养好的菌液1.5ml于Ep管中，冰上放置3min；4℃，4000rpm离心5min，去上清，收集菌体。从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳(冰浴原因：使细菌停止生长，代谢减慢，因为这时已经没有培养基了，如果细菌仍有很高的代谢率，则有大量细菌死亡。） 用500ul预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴10min。（细菌处于0度，CACL2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，外源DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸盐混合物粘附于细胞表面（羟基来源于细胞壁上的糖，磷酸来源于DNA））。 4℃，4000rpm离心5min，弃去上清液，加入50ul预冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞后置于冰上20min，即制成了感受态细胞悬液。 向感受态细胞中加入10ul重组质粒DNA溶液，轻轻混匀，冰浴25min。Ep管4 ℃预冷 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90s（不要摇动Ep管！）（42度热处理能促进细胞吸收DNA复合物）。 然后将Ep管迅速转移到冰上，冷却3min。 向上述管中加入400ul 的LB液体培养液，然后37℃，100rpm，振荡培养约45-60min 2）转化 取100ul转化细胞至含有抗生素（氨苄青霉素）的LB平板上，用灭菌的玻璃棒（