DNA扩增产物的鉴定.ppt

细胞与遗传实验 DNA扩增产物的鉴定 一、限制性内切酶酶切技术 原 理 限制性内切酶（restriction endunuclease）：生物体内能识别并切割特异双链DNA序列的一种内切核酸酶。 可以将外来的DNA切断-----限制异源DNA的侵入并使之失去活力 对自己的DNA却无损害作用----可以保护细胞原有的遗传信息。 由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶(简称限制酶)。 限制酶识别序列的长度一般为4-8个碱基，最常见的为6个碱基。 （Ⅱ 型限制酶） sticky ends EcoRI blunt ends SmaI 重组技术应用 在疾病检测中的应用 选择合适的内切酶切割扩增产物 通过片段大小鉴定基因是否有缺失或缺陷。 Leber遗传性视神经病（LHON） 线粒体遗传病 mtDNAG11778A 系谱特点： 男女均有发病 三代均有患者出现 女性患者将疾病传递给后代，而男性患者不能将疾病传递给后代 女性不发病，但其后代患病 不符合孟德尔遗传规律，而呈现母系遗传 线粒体遗传多质性、异质性、阈值效应~~ 原 理 本实验使用限制性内切酶（SfaN I） ，酶切位点： 5′….GCATC(N)5↓…3′ 3′….CGTAG(N)9↑….5′ 正常人样品具有酶切位点，能够被酶切开，分成2个片断（797bp+127bp）；而病人组G则被A替代，酶切位点丧失，不能被酶所切动，所以还是１个片断（924bp）。 1－9道依次为： 1：DNA marker 2：Ⅱ1 11778位扩增产物酶切片段 3：Ⅲ3 11778位扩增产物酶切片段 4：Ⅲ4 11778位扩增产物酶切片段 5：Ⅲ5 11778位扩增产物酶切片段 6：Ⅳ6 11778位扩增产物酶切片段 7：Ⅳ7 11778位扩增产物酶切片段 8：正常人 11778位扩增产物酶切片段 9: 11778位扩增产物 器材与试剂 高速离心机、恒温水浴箱、移液枪、枪头、塑料离心管等 Lwe I（SfaN I ）（ER1621）限制性内切酶、三蒸水、缓冲液等 操 作 1、取样品（病人、正常） 缓冲液10× 1ul 扩增产物 6ul 内切酶 3ul 2、置37oC水浴3h（或过夜） 10ul混匀 注意事项 影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) DNA的甲基化程度； (3) 酶切消化反应的温度； (4) 溶液中离子浓度及种类； (5) 缓冲液的 pH值。 内切酶需在－20℃环境中保存。 内切酶活性的发挥需要Mg2＋ 。 为使酶反应时达到最佳条件，需使用生产厂商提供的反应条件或缓冲液。 二、琼脂糖凝胶电泳技术 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖溶化再凝固后能形成带有一定孔隙的固体基质的特性，其密度取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用下及中性pH的缓冲条件下带负电的核酸分子就可以向阳极迁移。 原 理 原 理 溴化乙啶（EB）3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA。 一定量的DNA加入琼脂糖凝胶，能与凝胶中的EB结合，在电泳缓冲液（TAE）中，进行电泳。由于电场作用，DNA分子会从负极向正极泳动，分子量小的泳动在前，大的在后，形成不同的DNA条带。 以标准Marker为参照物，可以估计被检DNA的大小。    原理 影响DNA在琼脂糖中迁移率的因素：DNA分子的大小、DNA的构象、电压、电场方向、碱基组成、嵌入的染料以及电泳缓冲液的组成。 器材与试剂 紫外透射仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶板、凝胶梳、薄膜、 移液枪、枪头、塑料离心管等 1％琼脂糖（含溴化乙啶）凝胶、 DNA样品、标准Marker、 上样缓冲液（6×）、TAE缓冲液等 操 作 1、制备1.5%凝胶板（120ml）：已配置好的琼脂糖溶液加热溶解后， 至50-60 ℃时，浇板；冷却后，置电泳槽内，并 轻轻拔出梳子。 2、制备上样样品：在塑料薄膜上加 上样缓冲液5 × 2ul 样品　　　　　　　　　　　　　　　　　 8ul （酶切产物，