流式细胞术实验原理及应用.ppt

七、荧光补偿 流式细胞分析中常需要两种或两种以上不同荧光素标记的单克隆抗体进行多色分析。由于目前使用的各种荧光染料都是宽发射光谱性质，发射光谱范围有一定的重叠，出现结果误差，克服这种误差的有效方法就是使用荧光补偿。 八、数据分析 流式细胞术的目的是对我们感兴趣的细胞进行分析，其中设门技术是流式细胞数据分析中最为独特的技术，是指在细胞分布图中指定一个范围或一片区域（门），对其中的细胞进行单参数或多参数分析。设门包括线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意门和四象门等。 任意门、矩形门 　　 线性门 四象门 多重逻辑门：当一种细胞有两种以上的参数需要被 分析时，常需要设多个门，各门之间由此出现逻 辑关系，此种设门技术称为多重逻辑门或联合门。 淋巴细胞 T淋巴细胞（CD3+） CD3+CD8- IFN-r IL-4 （CD4+） 数据显示采用的图:散点图、直方图、密度图和二维等高图等。最常用的为单参数直方图和双参数散点图。 参数的意义: FSC的强度与细胞的大小有关，也就是说，细胞越大，散射光越强，细胞越小,散射光越弱; SSC对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可反映细胞颗粒性程度大小。 单参数直方图X轴代表荧光或散射光的强度，Y轴代该道所具有相同光信号细胞的频率或相对的细胞数； 双参数散点图X轴和Y轴均代表散射光或荧光的强度. SSC FSC 　　　 九、流式细胞术的应用及标记方法 1、DNA含量分析 （细胞周期分析） 意义：肿瘤的早期诊断，肿瘤的良恶性判断，观察细胞的增殖状态及细胞周期分布。 正常生物细胞，DNA含量随着细胞增殖周期时相而发生变化。即G0/G1期（2C）、S期（2C→4C） G2/M期（4C）。 2C 2C→4C 4C FCM进行细胞周期DNA含量分析时，需要对DNA进行染色，DNA染料（PI）与DNA结合具有特异性，有一定量效关系，即DNA含量的多少与荧光染料的结合量成正比，荧光强度与DNA吸收荧光分子多少成正比。FCM分析一个 细胞群周期与DNA倍 体时，将DNA含量直 方图分为三部分， 即G0/G1、S、G2/M 三个细胞峰。 G2/M (4C) G0/G1 (2C) S (2C→4C) G2/M (4C) 2、 淋巴细胞亚群分析 　白细胞分化抗原（CD分子）的命名： 　　　1982年世界卫生组织和国际免疫学会联合会，将所有抗体根据白细胞分化抗原反应性的类型划分为25群，把每一群抗体称为一个分化抗体群(Cluster of Differentiation，CD)，进行编号、命名，即为单克隆抗体的国际命名法。由CD抗体群识别的分化抗原就称为CD分子。目前已有339个分化抗体群被鉴定并命名 淋巴细胞 T淋巴细胞（CD3+） CD3+CD8- IFN-r IL-4 （CD4+） 3、 FCM检测细胞凋亡 细胞凋亡是细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序结束其生命的过程。细胞凋亡为一种可调控的、主动的细胞死亡过程，有很多的促进或抑制凋亡的调控途径存在，因而就可以人为地诱导或抑制某些细胞的凋亡，从而达到防病、治病的目的。 被认为比较成熟的方法： 　 PI单染色法 Annexin V／PI双染法。 TUNEL法 碘化丙啶（PI）单染法（DNA周期分析）： 　　　由于凋亡细胞DNA被降解，小分子DNA可通过细胞膜渗透到细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成凋亡细胞DNA含量减少，与荧光染料结合减少，荧光强度减弱，在DNA直方图上显示在G0/G1峰前出现一个DNA含量减少的亚二倍体峰，称凋亡细胞峰。 　 Annexin V／PI双染法： 　　　在凋亡细胞的形态学改变中，胞膜的改变是最早的。在细胞凋亡早期，细胞膜内侧磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内层翻转，暴露在凋亡细胞表面，构成早期凋亡的重要生化特征，PS被特异的Annexin V-FITC探针所标记，而PI对细活细胞和早期凋亡细胞是拒染的，故Annexin V-FITC/PI双染法能区分活细胞、早期凋亡细胞和死亡细胞。 机械损伤细胞： Annexin V -/PI+ 晚期凋亡、坏死细 胞：Annexin V +/PI+ 早期凋亡细胞： Annexin V +/PI- 活细胞： Annexin V -/PI- TUNEL法： 　　　细胞凋亡时，双链DNA会出现断裂点，即产生一系列3’端。在脱氧核糖核酸转移酶(TdT)催化的反应下，能将荧光素--脱氧尿苷三磷酸(dUTP) 标记到断裂的DNA末端，从而使凋亡的细胞具有荧光。 THANKS * 流式