蛋白质的理化性质和分离纯化手段课件.ppt

复旦大学生物化学系 黄伟达 有一蛋白质分子量14kDa, pI 10.2, 65℃不变性, 50%酒精不沉淀, 请设计分离纯化方案。 思考题 * * * * 黄伟达 蛋白质的理化性质和分离纯化手段Characteristics of Proteins Purification methods 复旦大学生物化学系 黄伟达 疏水区域 Distribution of electronic charges and hydrophobic areas on protein surface 蛋白质分子上的电荷与疏水区 复旦大学生物化学系 黄伟达 Protein Solubility pI 蛋白质在等电点的溶解度最小 pH与盐浓度对蛋白质溶解度的共同作用 复旦大学生物化学系 黄伟达 Salting-in Salting-out 硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响 离子强度 盐 析 盐溶 蛋白质的盐析 复旦大学生物化学系 黄伟达 1708年Reuss的实验 1930年Tiselius的装置 The early electrophoresis apparatus 最早的电泳装置 1948年分离血清蛋白的工作获得诺贝尔化学奖 复旦大学生物化学系 黄伟达 Most useful types of electrophoresis 等电聚焦 纸电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 O’Farrell的双向电泳 几种常用的电泳 复旦大学生物化学系 黄伟达 O’Farrell’s 2-D Electrophoresis 银染结果 考马斯亮蓝染色为蓝色 O’Farrell的蛋白质双向电泳 复旦大学生物化学系 黄伟达 Protein Purification 复旦大学生物化学系 黄伟达 Principles of Protein Purification 选择好的材料 摸清目的蛋白质的稳定性 探索有效的抽提法和浓缩法 建立一套层析的组合 以较好的方法贮存 蛋白质分离纯化的几个基本原则 复旦大学生物化学系 黄伟达  初提 精纯化 盐析 ? 离子交换层析 有机溶剂沉淀 ? 分子筛层析 等电点沉淀 ? 疏水/反相层析 结晶 ? 亲和层析 Steps for Protein Purification 蛋白质分离纯化的具体方法 复旦大学生物化学系 黄伟达 What is chromatography? March 21, 1903, Meeting of the Warsaw Society of Natural Scientists, Mikhail Semenovich Tswett presented a lecture entitled On a New Category of Adsorption Phenomena and its Application in Biochemical Analysis. 复旦大学生物化学系 黄伟达 □□□□■ □□□□□ □□□□■ ■□□□□ □□□■■ ■■□□□ ↓ □□□□□■■■■■■■■■ ■■■■■ □□□□■ □□□□□ □□□□■ ■□□□□ □□□■■ ■■□□□ ↓ □□□□□■■■■■■■■■ ■■■■■ Martin马丁 Synge’s 辛格 Countercurrent distribution model K=1/2 K=2/1 逆流分配模型 ??????????????????????????????? 1952年获奖 复旦大学生物化学系 黄伟达 Separation resolution proportional to theoretical plate number 检测器应答 好柱子 差柱子 理论塔板决定层析效果 复旦大学生物化学系 黄伟达 Theoretical plate number is inversely proportional to particle radius 理论塔板决定层析效果 因此层析载体的粒径越小，分离效果越好。这就是为什么要发展高压液相色谱（HPLC） 复旦大学生物化学系 黄伟达 HPLC MPLC中低压制备色谱仪 泵的结构 HPLC层析系统 复旦大学生物化学系 黄伟达 For lab use For i