实验三－线粒体的分离与观察.ppt

上次实验总结 实验三 线粒体的分离与观察 指导教师：何春梅 林建中 1 实验目的 用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。 2 实验原理 离体的线粒体（mitochondria）的分离是研究线粒体结构与功能的基础。 采用组织匀浆在悬浮介质中进行差迷离心制备线粒体。在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。 线粒体的鉴定用詹纳斯绿B活染法。詹纳斯绿B(JanusgreenB)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。 3 实验材料,仪器和试剂 3.1 实验材料： 绿豆芽（菜市场购买） 显微镜 3.2 实验仪器： 高速离心机、显微镜、小烧杯、纱布、研钵、载玻片、盖玻片。 显微镜 离心机 研钵 3.3 实验药品和试剂 (1) 分离介质：0．25 mol／L蔗糖，50 mmol／lTris-盐酸缓冲液(pH7．4) ，3 mmol／L EDTA，0．75mg／ml牛血清白蛋白(BSA) (2) 保存液：0．3mol／L甘露醇(pH7．4) (3) 超活染色液：1％詹纳斯绿B染液 4 实验步骤 4.1 差速离心分离线粒体 ⑴ 选取绿豆芽，去掉下胚轴下部和根，保留下胚轴上部和子叶等。 ⑵ 加3倍体积分离介质，在瓷研钵内快速研磨成匀浆 ⑶ 用多层纱布过滤，滤液经700×g离心10min。除去核和杂质沉淀。 ⑷ 取上清液10 000×g离心10 min，沉淀为线粒体。再同上离心洗涤一次。 ⑸ 沉淀为线粒体，可存于0．3mol／L甘露醇中。注意以上匀浆化及离心均控制在0-4℃进行。 绿豆芽材料的选取 加入分离介质 研磨 提取匀浆液 差速离心 4.2 线粒体的超活染色及观察 取线粒体沉淀涂在清洁的载玻片上，不待干立即滴加1％詹纳斯绿B染色20min，放上盖玻片，用显微镜观察，线粒体是蓝绿色圆形颗粒。 5 实验数据的记录和分析 拍照分离的线粒体，检查是否混杂细胞核和胞质碎片。 估计分离线粒体的纯度。 祝大家取得好的实验结果！