细胞培养中常见问题及解决方案.ppt

72﹪持续使用抗生素培养的细胞有支原体感染 支原体污染电镜照片(X30k) 煎蛋状和其他形状 造成支原体高污染率的原因 支原体 size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般 过滤膜（0.22-0.45 um） 支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜 可观察到的特征变化  缺乏简单、快速且可靠的检测方式  细胞流通间缺乏物品管理，造成 实验室间的相互污染 操作人员忽略污染问题 预防与控制 设备方面： 1、使用已确定无支原体污染的细胞株 2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染 之细胞 3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞 检测方面：定期以标准的支原体 检测方法检测细胞、 培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染 实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求 对支原体最有抑制活性及常用于支原体感染治疗的抗生 素是四环素类、大环内酯类及一些氟喹诺酮。 对污染细胞的抢救 将细胞离心后用PBS液洗两遍，将细胞注入小鼠腹 腔，一周后无菌收集腹水细胞（或实体瘤细胞）。 黑胶虫污染 黑胶虫 黑胶虫是一种生物，直径小于0.1um （纳米细菌） 存在于血清中 生长缓慢，与细胞生长有此消彼长的关系 应对方法 更换血清 勤换液（贴壁细胞可用无菌PBS洗几遍， 悬浮细胞可加入小鼠腹腔巨噬细胞） 使用新的一次性塑料培养瓶 细胞的交叉污染 不在同一超净台内同时进行不同细胞的操作 同时培养两种细胞时，所有物品应分开使用 重要细胞系的传代应有两人独立进行 从别处转来或自己建株的细胞要留有充足的冻存储备 警示！ 污染的细胞必须经灭菌后，方可丢弃。 彻底消毒CO2孵箱。 查明污染原因后，再重新复苏细胞。 三. 细胞的冻存与复苏 细胞冻存的注意事项 及时、足量的冻存。 欲冻存的细胞应生长状态良好，存活率＞90﹪， 并有80-90﹪致密度，细胞数目应 ＞1-5×106/ml 冻存细胞应保证其特有的性质（如:是否有抗体产生） 注意冷冻保护剂的品质，DMSO应为试剂级等级 冻存液的配置：90﹪小牛血清中加10﹪DMSO （使用前应置4℃） 冷冻方法 传统方法： 4℃ 10分钟→ -20℃ 30分钟→-80℃ 16-18小时 （或过夜）→液氮罐。 程序降温： 利用等速降温机以-1～-3℃/分钟的速度由室温降 至-120℃后放入液氮罐中。 -70℃过夜后，移入液氮罐中。 细胞复苏的原则 快速融化 以避免冰晶重新结晶而对细胞造成的伤害导致细胞死亡 注意事项 提前做好准备工作及个人防护工作 取出冷冻管应立即放入37℃-42℃ 水槽中，轻摇冷冻管使其在1分钟 内全部融化 水槽液面不要高于或接近冻存管口， 以防污染 复苏后，离心去除冻存液 谢 谢！ 细胞培养中常见问题及解决方案 单克隆抗体制备流程 建立有关肿瘤相关分子以及免疫新分子 单克隆抗体的制备及应用的协作研究 获得国际合作研究经费1000多万元 英国牛津大学 澳大利亚纽卡绍尔大学 美国路德威格癌症研究所 一. 细胞养不好的原因及对策 二. 怎样预防和应对细胞培养中的污染问题 三. 细胞的冻存与复苏 一.细胞养不好的原因与对策 有没有污染？ 生长状态是否正常？ 是否需要换液补充营养？? 动作要轻柔 大胆丢弃细胞，只留1/3或1/6最佳 培养基 血清的筛选 其他(细胞生长刺激因子，饲养细胞） 培养基 pH 缓冲体系 水 缓冲体系 HEPES 是一种非离子两性缓冲液,其在pH 7.2 - 7.4 范围内具有较好的缓冲能力。 其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。 使用超纯水 血 清 胎牛血清和新生（出生后24小时内未吸奶）的小牛血清 批间差异很大 血清的筛选非常重要 血清的筛选 细胞培养法筛选 克隆化法筛选 杂交瘤细胞的克隆化 克隆化—即把培养孔中的细胞从单个细胞进行培养繁殖，使之成为单克隆，其分泌的抗体达到均一性。 有限稀释法 濒临死亡细胞的挽救 生长状态不好，而又比较娇贵的细胞。加入细胞生长因子（IL-6） 活细胞数量非常少的细胞， 移植于24孔培养板中，并加 入饲养细