研究细胞的方法.ppt

临界液的选择 一般将临界干燥中起临界干燥作用的液体称为媒介液（又称过渡液），它的选择条件是临界温度及压力较低、价格便宜而已保存方便。 液态CO2的临界温度为31.4 ℃，临界压力为72kg/cm2，与其它媒介液相比更符合选择条件。因此，在临界点干燥时，液态CO2已被普遍使用。 临界点干燥的操作程序 1）样品预处理 2）放置样品 3）注入液体CO2 4） CO2 置换 5）临界处理 6）放气取样 生物样品的导电处理 生物样品尤其是经干燥处理的样品,其表面电阻率很高,导电性能很差,当接受电子束照射时,易造成充电和放电效应,以至图像模糊不清。 此外生物样品元素成分原子序数低,二次电子发射率低,也难得到反差适当的图像,为增加导电性能,提高二次电子发射率,必须对样品进行导电处理。 电镜的历史 1935年 法国的卡诺尔提出扫描电镜的设计思想和工作原理。1942年 剑桥大学的马伦首次制成世界第一台扫描电镜。 一、分类： 透射电镜 （Transmission electron Microscope TEM） 扫描电镜 （Scanning electron Microscope SEM ） 1、透 射 电 镜 1）、透射电镜标本制备过程: 取材:尽可能保持生活状态,避免损 伤必须耐真空由于电子穿透力 弱,标本必须超薄标本反差应 尽可能大(生物材料原子系数 低,图像反差差,不易出现明暗 差别) 固定:为防止生物样品在死亡后和脱水 过程中产生结构改变,离体生物 标本迅速固定。常用戊二醛和四 氧化锇固定戊二醛在蛋白质分子 之间形成共价键,将它们交联在— 起。四氧化锇除与蛋白共价结合 外,还对脂类有良好的固定效果。 脱水:标本必须置于高真空中进行电镜观察,但 电镜不能观察含水的生物标本，因此需 经脱水处理。另外由于包埋剂与水不溶， 用脱水剂可将组织中游离水脱去，有利 包埋。 包埋:为使柔软生物组织制成超薄切片,并使切 片耐受高真空、电子轰击,则在切片前将 标本进行包埋,常用环氧树脂。 切片:电子穿透力很弱,需将样品制成50～100nm 厚的薄片。 染色:生物分子由原子序数低的轻元素组成,.它 们散射电子能力弱,在电镜下几乎不存在明 暗反差,为加大生物样品反差,进行染色。 常用的染色剂：醋酸铀、枸橼酸铅。 2）、提高样品反差的方法 负染法(negative staining) : 将病毒、纤维、核糖体或分离的生物大分子样品放于覆有亲水性支持膜的载网上,滴加磷钨酸,样品干燥后重金属盐沉积于样品周围使样品和背景形成显著的明暗对比,这种染背景而不染样品的方法叫负染。 真空镀膜法(meta1 shadowing): 把铂或钯等重金属接受高温蒸发,金属颗粒以一定倾斜角度喷落在样品表面形成不同厚度的薄膜,膜的厚度反映了样品的表面轮廓，主要观察病毒、噬菌体或大分子的形状。 整装细胞电镜技术: 应用高锰酸钾固定剂,将细胞中大部分蛋白质性结构破坏,而内质网等膜性细胞器保存下来。这样不需超薄,细胞中的内质网膜系统及高尔基复合体、溶酶体和线粒体等膜性结构就能显现出来。 冷冻蚀刻复型电镜技术 (freeze etching rep1ica e1ectron microscopy) 将标本用液态超低温冷冻,真空中割断,升温使冰升华,细胞内外凡含水多的地方因失水而下陷,膜和其它一些结构显露出来,增强了断面的浮雕效果－蚀刻。 标本蚀刻后以45°喷金,90°喷碳后将组织溶解掉,剩下的碳-金属膜就是复型。将复型膜置于透射电镜下观察,可观察蚀刻面所暴露的各种微细结构。 冷冻：制冷剂（一般为液态氮）快速冷冻，使样 品固定。 断裂：在低温真空中将样品劈开，断裂面上可见 各种细胞内结构 蚀刻：升温使冰升华，细胞内外含水多的地方因 失水而下陷，膜和其它结构显露出来，增 强了断面的浮雕效果。 复型：以45°喷铂金，90°喷碳固定，显示立体 结构 剥膜：将样品取出，浸泡于腐蚀夜中将生物组织 腐蚀掉，只剩下铂－碳复型膜，捞于载网 上干燥后透射电镜观察 扫描电镜照片展示 注射针头的扫描电镜照片 扫描电镜照片展示 不同倍率的果蝇扫描电镜照片 扫描电镜照片展示 可以用计算机将黑白照片处理成彩