细胞微生物学研究方法.ppt

STM技术tags的构建：可变区40bp，由4个碱基随机排列而成，理论上可形成1012种不同DNA片段。 STM 的特点 通过联合转座子插入诱变技术和体内负筛选原则使筛选策略由原来针对单个突变株的逐一鉴定转变为针对复杂突变体群的系统筛选，筛选过程更为快捷与系统； 特异性DNA 序列对突变体的逐一标记也能轻易地鉴定出被突变的基因，将工作量和实验动物用量降到最低。 STM 的局限性 一是插入性诱变实验存在的共同局限性，如插入事件存在随机性，使得某些较小基因片段(400 bps)的插入性转座诱变较难实现；某些基因区域本身为体内转座或重组的热区或冷区也影响着转座诱变作用的成功率；需要建立能方便地从其感染器官组织中回收尚且存活的细菌突变株的合适动物模型等。 另一方面的局限性则为STM 技术所特有，包括：标签信号衰减的影响；众多突变体株同时收集并实验可能导致其中某些单一信号的削弱，从而影响结果可靠性；另外，由于多个突变株同时存在并共同作用，突变株之间的缺陷代偿可能导致某些突变基因不能被筛选与鉴定，出现假阴性结果等。 体内表达技术In vivo expression technology，IVET 利用病原基因组随机片段与缺乏启动子的报告基因构建融合载体（启动子诱捕文库），在动物体内重组到细菌基因组中而使报告基因表达，筛选病原菌感染过程中表达基因的方法。 采用常规的分子生物学技术即能进行筛选，不需要昂贵的仪器设备，优势明显；不需要对目标病原菌的基因组特性进行深入详细的认识即可对细菌在宿主环境条件下的基因表达情况进行分析研究。 Example: 鼠伤寒沙门菌purA缺陷型模型 purA基因作为可选择的报告基因； lacZ基因（编码β-半乳糖苷酶）供体外选择。 差异荧光诱导（DFI） 以GFP为报告基因来监测启动子活性。 将GFP 编码基因置于目标病原菌启动子文库的下游，采用荧光激活细胞分选术对包含有启动子-GFP融合活性的菌落与不能表达GFP 的菌落进行分离，通过对体内及体外环境中荧光细胞的连续分离与比较以确定仅在体内环境中存在的细胞及相应的突变基因。 gfp基因 编码一种水母蛋白-绿色荧光蛋白（GFP），在受到蓝光激发后会发出绿色荧光。GFP的一个重要特征是它的荧光信号能通过FACS来检测，这意味着含有与gfp基因融合的启动子库的细菌可自动筛选出活化的启动子，这样成千上万的启动子可在数分钟内被分离。FACS还能分选表达GFP的细菌粘附或内在化的真核细胞，使检测由于和宿主细胞相互作用而激活的细菌基因成为可能。 将荧光激活细胞分选术和基因组学研究进行整合，对微生物基因表达情况进行高通量的半自动筛选，操作简单、迅速、实验重复性高； 具有荧光性质稳定，无细胞毒性，不干扰细菌在宿主体内的侵袭、扩散和增值过程，可直接用于活细胞测定等优点。 GFP 的运用使研究者能对基因的表达情况及单细胞水平的启动子活性进行客观观察与分析，并可通过简单改变荧光阈值来调节选择敏感性。 DFI的特性 不能检测需要转录后调节的基因； 需要构建和分析目标基因突变株以评估靶基因在天然感染中的作用； 细菌的聚集与粘附可能影响流式细胞分类与检测分析； 研究环境的pH 变化、氧气供给情况以及缺乏信号放大效应等也会影响GFP 的使用； 由于荧光为非线性信号，每次实验时都需要对信号的线性范围进行检测和校准以确保准确量化基因的表达情况； 采用细胞模型，不适用于动物模型的筛选，因此筛选结果不够全面，不能反映致病菌感染的全部环节。 DFI的缺陷 体内诱导抗原技术 IVIAT （in vivo induced antigen technology） 直接从“蛋白”角度入手筛选毒力基因 Handfield及其合作者于2000年在研究口腔病原菌时设计提出，通过对表达文库进行免疫筛选得到病原菌的体内诱生基因。 作为一种简单有效的筛选技术，IVIAT 已被成功用于多种病原微生物ivi gene 的研究中，如猪链球菌、炭疽杆菌、伤寒沙门氏菌以及白色念珠菌等等。 体内诱导的抗原技术 取感染过所研究病原体的多个病人的血清，用体外生长的该病原细胞将相应抗体全部吸收，只留下仅在体内表达的抗原的相应抗体。 在合适的宿主中建立该抗原DNA的表达库 用吸收后血清探测这些克隆 有反应的克隆即产生自然感染而非体外培养过程中表达的抗原，通过纯化、测序，即可鉴定体内诱导的抗原基因。 将这些抗原纯化，用于证实IVI抗原确由病原体在感染过程中表达。 IVIAT的特点 IVIAT不依赖于动物模型，而是以急性感染患者的恢复期血清为探针筛选病原菌的 ivi gene，应用范围广泛，可真实全面地反映病原菌与人类感染宿主之间的相互作用。 仅使用简单的免疫学和常规基因组