重组体导入受体细胞的原理与技术讲义.ppt

* * * * * * * * 精子进入卵细胞后，尾部消失，头部变圆膨大，形成雄原核；卵细胞完成第二次有丝分裂后，其细胞形成雌原核。雄原核与雌原核接触，各自的核股消失、融合，二性染色体在其后的台子分裂中混合、配对，受孕宣告结束，一个新生命宣告开始。受精过程约需24小时。 * * * * * * * * * 操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、效果稳定，但转染效率低。 2. 脂质体介导法 脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。 脂质体（lipofectin）载体法 应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 3. 显微注射法 1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段 2）收集受精卵：受孕后几小时内 3）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核 4）受精卵移植 显微注射法(microinjection) 二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。 4. DEAE-葡萄糖转染法 葡聚糖 葡聚糖 DEAE-dextran 外源DNA 细胞 混合 DEAE-dextran对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。 4. DEAE-葡萄糖转染法 导入外源DNA的几种方法 三、转化率及影响因素 转化率（cfu / μgDNA）：每微克重组DNA转化后，接纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。 （一）转化率的计算： 转化率 ＝ 产生菌落的总数 / DNA的加入量 三、转化率及影响因素 例：取1μl（0.1 ng/μl）完整的质粒转化100μl的感受态细胞。向转化反应液中加入900μl培养液，让细菌恢复一小段时间，取100μl铺板。培养过夜，产生1000个菌落，转化率为多少？ 转化率＝1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /μg 三、转化率及影响因素 例：某一DNA重组实验的重组率为20%，转化率为107 cfu / mg 天然载体，经酶切和连接处理后的重组载体转化率比天然载体约低100倍，欲获得104个重组克隆，需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？ 104 ＝ 107 cfu / mg ×10-2 × a × 20% 重组载体 a = 0.5 mg 三、转化率及影响因素 普通的亚克隆实验：1×10 6 cfu/μg DNA； 更复杂的亚克隆：1×107 cfu/μg DNA，如有限量的DNA的转化，T-A克隆； 构建文库： 1×108 cfu/μg DNA。 1）载体DNA类型、大小；重组DNA浓度、纯度 2）受体细胞 3）转化方法：同一转化方法技术参数影响转化率 （二）转化率的影响因素 三、转化率及影响因素 影响转化率的因素 （2）感受态细胞（competent cells) ①生长状态制备 感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 ③CaCl2处理 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ⑤使用感受态菌时必须迅速融化 融化后一般不能再次冻存使用。 * * * * * * * * * * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验材料(如烟草)的叶子表面进行消毒,再用消毒过的不锈钢打孔器从叶子上取下圆形小片,即叶盘.为了对叶盘进行接种处理,需将它放在土壤农癌杆菌培养液中浸泡4~5min,然后用滤纸吸干,放在看护培养基上进行培养 * 先将实验植物材料，例如矮牵牛的叶片进行表面无菌消毒，用经过消毒的无菌不锈钢打孔器从叶片上取下圆形小片，即所谓叶盘，然后接种上含有重组Ti质粒的根瘤土壤杆菌。这种经接种处理的叶盘，在饲养平皿的滤纸上培养2天后，将滤纸连同叶盘转移到含有适量的卡那霉素的“长芽”培养基(shooting emdium)中，进行筛选与再生，接着再转移到“生根培养基”(rooting medium)上诱导幼芽生根，最后将小植株移栽在土壤中