流式细胞仪技术.pptVIP

CD34+阳性细胞绝对计数 对于微量细胞的分析，去除背景信号或细胞碎片非常重要 利用核酸染料(FL-1)能够识别完全的有核细胞，如白细胞和有核红细胞；去除细胞碎片、成熟红细胞、血小板 造血祖细胞CD45弱阳性，利用CD45-PerCP/SSC去除淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、死细胞、细胞碎片、聚集血小板和有核红细胞 CD34-PE抗体标记造血祖细胞 IgG1-PE作为阴性对照 左图根据核酸染料(FL1)去除细胞碎片确定祖细胞位置 中图依据CD45染色(FL3)减少CD45强阳性细胞； 同时根据SSC去除非祖细胞的高SSC细胞； 右图显示R1和R2区的细胞及R3的标准珠；通过FL1/FL2清晰区分出CD34+细胞群； 根据R3区的数量计算CD34+细胞的绝对数。 R4÷R3×51700÷50ul * FCM在临床肿瘤学中的应用 利用FCM检测染有碘化丙啶（Propidium iodide，PI）的细胞，对肿瘤细胞DNA含量作出定量分析,通过研究细胞的周期变化及细胞异倍体的测定,预测各种肿瘤治疗的预后；在肿瘤化疗中对药物的选择，及放疗中对强度、时间的决定等起着指导作用；解释抗癌药物的作用机制；对癌症进行早期诊断及鉴别良恶性有一定的参考价值。而且，FCM 对细胞凋亡、抗凋亡蛋白质、周期蛋白、癌基因、抗癌基因的研究，均可揭示肿瘤的发生、发展机制；并对肿瘤预防、治疗和预后的评价等方面起着重要的作用。 * 凋亡细胞 特性：① 细胞内的内切核酸酶的激活，导致细胞中低分子量DNA的出现,进而减少了DNA的特异的荧光染色。② 凋亡的细胞具有完整的细胞膜，对碘化丙啶（Propidium iodide，PI）染料具有排斥反应。③ 早期的细胞凋亡表现为细胞膜的不对称的丢失，即磷脂丝氨酸残基在质膜内外层分布的改变。利用一种抗凝结蛋白（Annexin V，既能优先与负离子的磷脂如磷脂酰丝氨酸结合，又能与荧光染料结合）的亲合性进行检测。 * 凋亡细胞流式细胞仪的分析方法 Annexin Ⅴ分析 PI染色分析 DNA断片的分析 * Annexin Ⅴ分析原理 * Annexin Ⅴ分析图 * PI 染色原理 PI(碘化丙啶,Propidium iodide)是一种插 入性的荧光染料，能够嵌入双链核酸（DNA和RNA）的碱基对中，经RNA酶的处理后，细胞中的RNA被消化掉，PI可对DNA进行特异的染色。 * PI染色分析 * DNA 断片的分析原理 * PI-FITC 双标记 * FITC-BRDU标记DNA断片 * * * 消除非特异性结合-FcR阻断 对于小鼠细胞需要用于FcR阻断剂(纯化的抗Fc?II/III受体抗体)减少非特异性荧光染色； 对于人和兔细胞可以应用纯化同种的Ig或血清预先阻断Fc受体 * 对照的设置 细胞固定和膜穿透后，应用同一克隆的无荧光素结合抗体处理，能够区分细胞因子特异和非特异染色 荧光素结合的Isotype Ig作为阴性对照，阴性对照的抗体浓度应该与抗细胞因子抗体的浓度相同； 细胞内细胞因子检测,可设阳性对照细胞。 * 激发光源与荧光标记物示意图 * 光谱重叠示意图 * 荧光补偿 流式细胞仪常用的荧光染料多数存在发射光谱的重叠，流式细胞仪的光学滤片系统最大限度地减少这些信号。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个信号成分的技术，典型例子是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。 * * * 光谱重叠的校正的示意图 * 多色荧光补偿的调节 两种发射荧光重叠的部分利用荧光(色彩)补偿调节来消除。 色彩补偿(Color Compensation):利用电子或数学方法从一个信号减少另外一个信号成分的技术，是校对一个波长区域的荧光信号在垂直轴的第二荧光的重叠。 * 设门的意义 细胞类型或亚型的鉴定 特殊蛋白质的分析 细胞的分选 * 细胞分选前后示意图 * 标本来源: 外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液 标本浓度： 106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释 抗凝剂： EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。 溶血剂： 保持细胞形态、红细胞裂解完全。 反应温度： 26～27oC，室温避光。 细胞处理： 样品处理的要求 * 细胞处理：细胞固定和膜通透,抗体滴度 检测细胞内的细胞因子表达，细胞必须在穿透细胞膜前被固定，以维持细胞的结构完整性； 细胞固定选用70%乙醇 4%(w/v) paraformaldehyde（中性pH, PBS缓冲液); 细胞穿透选用去污剂0.2%Triton X-100; 应用抗体标记的缓冲液含代谢抑制剂叠氮钠(0.09%w/v)，抑制抗体结合引