L门冬酰胺酶新纯化工艺项目总结.docVIP

L-门冬酰胺酶(Asp)新纯化工艺项目总结 1项目背景 L-门冬酰胺酶(L-asparaginase: Asp)是一种酰胺基水解酶，是 从大肠杆菌菌体中提取分离的酶类药物，它能专一地水解L-门冬酰 胺生成L-门冬氨酸和氨，是一种重要的抗肿瘤药物，临床适用于治 疗急性淋巴细胞性白血病、急性粒细胞性白血病、急性单核细胞性白 血病、慢性淋巴细胞性白血病、何杰金病及非何杰金病淋巴瘤、黑色 素瘤等。尤其是对儿童急性淋巴细胞性白血病(ALL)的诱导缓解期 疗效最好。 目前生产门冬酰胺酶的工艺很多，纯化工艺更是千差万别。以往 的研究一般仅局限于实验室制备或小批量生产，经过复杂的纯化步骤 获得纯度及活性符合要求的产品，但收率低，成本高，特别是操作成 本占整个纯化成本的很大部分。如果不考虑产品成本，仅为获得符合 要求的产品，上述数种工艺尚还可行，但是从获取生产利润的角度这 些工艺就不可行，而且在所有这些工艺中，生产过程的复杂性成为规 模化生产的制约因素，如何开发即简洁又具有实际操作性的新生产工 艺，实现Asp生产的规模化，获得高纯度、高活性、高收率的目标产 品成为我们所要研究的课题。 公司自生产Asp以来，一直采用初期研发阶段的生产工艺，步骤 复杂、操作成本高、生产能力受限。基于此我们从探索方便、简洁、 高效的生产工艺入手，主要在纯化过程及精制过程两方面对现有工艺 进行改进。 2新工艺介绍 新工艺分以下几步: 丙酮粉制作：将丙酮、离心后的湿菌体按2: 1 (v/w)比例 混合，搅拌20?30min,离心，过筛，自然晾干得丙酮干粉 抽提：将丙酮干粉与抽提buffer按1: 20 (w/v)比例混合, 37°C,搅拌1?1.5hr，得抽提液 纯化：抽提液加适量1M MnCl2溶液(1. 5ml/g powder),沉 淀菌体碎片及核酸，离心取上清；以1M Tris buffer调上 清pH值至8.0，沉淀析出，离心取上清；加入0.5倍体积 的乙醇，搅匀静置过夜，沉淀杂蛋白，离心得上清；再加 入0.5?0.75倍体积的乙醇，静置沉淀6?8 hr,离心得沉 淀。将沉淀溶于适当体积的原buffer中，既得纯度大于 80%,比活140?200IU/mg的粗提品 精制：将上述纯化液分别过DEAE-Sepharose及CM层析柱， 除去部分核酸及内毒素，既得符合要求的Asp产品 3新工艺特点 新旧工艺除最终精制过程略有相同之外，其它过程差异较大， 新工艺基本采用生化方法对体系进行分离处理，与旧工艺相比新工 艺从以下几点取得突破： 操作步骤简单 新工艺采用生化方法处理，只需经过三步沉淀即可得到 相对高收率及高纯度的产品，而旧工艺一般要经过一次DE、 二次DE、脱盐、三次DE、二次脱盐等5步才能得到与上述 生化方法处理级别相当的产品 精制过程效率更高 旧工艺采用挂DE、盐洗、脱盐、过CM柱的精制过程， 脱盐采用G-25柱，受电导率限制，往往要经过多倍率稀释， 劳动强度大，操作复杂。通过精制工艺的改进与优化，整个 过程只需一步DE即可获得高纯度的Asp产品，再过CM柱除 内毒素即可出原液 全程运行时间明显缩短 生化处理方法固有的简单性决定了整个过程的处理时 间大大缩短，新工艺步骤简单省时省力，全程仅需2?3天 时间，且大部分时间用于静置沉淀，而旧工艺因为存在反复 DE处理及脱盐操作，耗时较长，每批大概需要3?4天的时 间，且工人劳动强度较大 新工艺试剂耗用量少，综合成本低，收率高 新工艺体系小，前期纯化处理全部采用价廉易得的丙 酮、乙醇试剂，试剂耗用量低且可回收，综合成本低，旧工 艺因体系较大过程复杂，因而综合成本较高。旧工艺最终产 品收率10gAsp/kg wet cell左右，新工艺最终产品收率迗 13 gAsp/kg wet cell左右，产品收率较过去提高约30%， 而且采用现行精制工艺，依据破菌方法的不同，产品收率可 迖16?18gAsp/kg wet cell，如此，则按细胞表迗量算(Asp 表迗量：22g左右/ kg wet cell)目标蛋白的回收率可迗 74%,较过去目标蛋白的回收率43. 5%提高70% 适合大规模产品制备，特别是单批次百克级及以上产品的 制备 新工艺采用生化方法处理体系，步骤简洁，每一单元操 作即可独立进行也可同时进行，且可根据处理量大小任意放 大，在保证前期发酵能力的条件下，可以单批次生产上百克 级的产品，这为大规模产品制备提供了可能 4运行结果分析 就目前运行结果来看，无论是前期的生化处理还是后期的产品 精制均获得了比较理想的结果，处理结果重现性好，能获得高纯度 的Asp产品(纯度大于90%),收率也较过去大幅度提高，流程短， 步骤简单，分离效率高。具体见附表2。 5新纯化工艺有关问题的说明 (1) 结合新工艺的实际，进一步