MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用.PPTVIP

（一）简要操作流程 1.制备基质溶液 2.样品的制备 3.质谱分析 4.数据分析 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 制备基质溶液： 常用的基质有图示的4种。 基质种类可能影响质谱峰的形成。 有研究表明，DHB 50 mg/mL， * 50%乙腈，0.1%三氟乙酸为基质，检测液体培养细菌，可获得最佳质谱图。 现已有商品化的配套基质溶液可以购买。 MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 2.样品的制备 （A）直接挑菌落涂片（75% ～ 90%） （B）乙醇/乙晴处理（10% ～ 20%） 临床标本接种于培养基（液体或固体） 挑取菌落或取液体培养液，经水和乙醇处理 再经70%甲酸/乙腈（1：1）处理 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 3.质谱分析 取一定量样品上清液点加到靶盘上，晾干后再点等量基质（如CHCA等），放干后进行 MALDI-TOF-MS 分析 脉冲激光、模式、加速电压、激光强度等参数还未获得一个统一的模式，需要优化。 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 Ekin=1/2mV2 4.数据分析 通过软件处理质谱图，并进行主成分分析 *横坐标为质荷比（m/z），纵坐标为吸收峰强度 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 简要操作流程 * （二）MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 细菌菌种鉴定 多血清型细菌鉴定 耐药性不同的菌株鉴定 真菌的鉴定 血液、尿液及其他无菌液体标本的鉴定 粪便标本的鉴定 MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 1、细菌菌种鉴定 Eigner等应用细菌菌落直接检测上千株代表临床微生物实验室主要分离的细菌，能准确鉴定95.2%。 Seng等研究1066株分离细菌菌株，代表109个不同的种，84.1%能准确鉴定到种，11.3%只能鉴定到属。 Bizzini等分析1371株临床分离株发现93.2%能鉴定到种水平，5.3%到属水平。在鉴定到种的水，MS和传统生化方法平一致率为95.1%。 * MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 1、细菌菌种鉴定 在鉴定非发酵菌方面，用人类感染相关的37个属的248株非发酵菌建立数据库，测定80株临床分离菌，并且和16S rRNA基因序列分析比较。MS能鉴定67株（85.9%），9株鉴定错误，2株不能鉴定。 结论： MALDI-TOF-MS能准确、可重复地鉴定细菌且在10min内，不需要其他的耗材。? 结果错误或不能鉴定是由于MALDI-TOF-MS数据库不完善，大部分的差异是因为系统数据库相关的分类学差异。 * 2、多血清型细菌的鉴定 传统的细菌培养和生化鉴定方法无法对沙门氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌等多种与人类健康密切相关的多血清型病原菌进行分类，需要进一步采用血清学或噬菌体试验等技术。 应用MALDI-TOF-MS技术对这些多血清型细菌进行鉴定和分类得到了初步应用，在沙门氏菌分型中表现出较好的分型能力。 * MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 * MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用 * 一、现有的细菌检测方法及其缺陷 * 现有的细菌检测方法及其缺陷 经典方法 初步分类：菌落形态、显微镜检查、以及趋向性试验，如革兰染色、氧化酶和触酶。 鉴定属或种：以细菌生长代谢过程为基础的特征性的生理生化反应、选择培养基生长情况。 缺陷 虽然某些生化试验只需要数分钟即可完成，但对于绝大多数经过转种、培养的微生物标本，通常要得到一个完整的鉴定报告大约要24-48h，某些苛氧菌或生长慢的细菌则耗时更多。 操作繁琐、主观性强。 * 现有的细菌检测方法及其缺陷 分子生物学方法 1. 细菌核糖体（16S rRNA）基因序列分析： rRNA寡核苷酸序列是细胞中最稳定的序列，比DNA稳定的多。 细菌中有三种rRNA，23S、16S和5S，其中16S rRNA因其核苷酸数目适中、信息量大、具有高度稳定性、易于提取和分析而成为理想的细菌鉴定的研究对象。 通过分析比较细菌rRNA序列的相关性确定细菌种系的发生关系。 * 现有的细菌检测方法及其缺陷 分子生物学方法 2. 其他： 鸟嘌呤加胞嘧啶碱基比例的测定 (G+C mol%)， 核酸的分子杂交 实时荧光定量PCR 缺陷： 技术复杂、耗费高、假阳性率高、不能自动化、高通量。 不适合临床常规检测！ * 迫切需要找到一种新的病原微生物快速诊断的方法，以满足临床需要 * 现有的细菌检测方法及其缺陷 二、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 * （一）质谱的基本概念 * 质谱的基本概念 质谱法(Mass Spectrometry, MS)：