分子生物学常用技术(简化版).PPT

三、我们能用 PCR 做什么？ 自 PCR 技术创立以来，经近 20 年的发展，在基本 PCR 技术基础上产生了多种 PCR 的衍生技术，应用于各种不同的目的 基因克隆或亚克隆－－基因工程 特定基因表达量的分析 基因突变的检测－－基因诊断 病原体特征性序列的鉴定－－基因诊断 定点诱变－－第 4 节 DNA 序列测定－－第 3 节　 最常用的 PCR 是 RT-PCR RT-PCR：reverse transcription PCR 以 mRNA 为模板 先进行逆转录，再进行 PCR 为什么要以 mRNA 为模板？ mRNA 无内含子，克隆的基因可在原核表达 mRNA 的量代表了基因的表达水平 如何利用 RT-PCR 检测基因表达水平? 定量 PCR(quantitative PCR) PCR 产物的量与起始的模板量有关 利用 PCR 对模板 DNA 或 cDNA 进行定量测定 定量 PCR 一般用于特定基因 mRNA 水平的检测 RT-PCR 可用于基因表达水平检测 需设定内部参照物(reference gene)，如：GAPDH、actin、18s rRNA 等稳定表达基因 定量是相对的，一般是不准确的 为什么说 RT-PCR 定量是不准确的？ 指数扩增期，产物量与模板量成正比 进入平台期，产物量不能再反应模板量 不同样品进入平台期的循环数不同，难以选择测定的时间节点 有精确定量方法吗？ 实时荧光定量 PCR(real-time PCR)： 以产物量到达一定阈值所需要的循环数为定量标准 需要对 PCR 产物的生成量进行动态监控 如何进行产物量的实时检测？ 需要荧光标记探针与两侧 PCR 引物 探针标记有报告荧光与粹灭荧光 反应过程中探针被降解，报告荧光显色 可通过荧光定量 PCR 仪进行实时监控 巢式 PCR 可以提高扩增效率和特异性 Nested-primer PCR 内外两套引物分两轮进行扩增 在克隆一些低丰度基因时可以采用 经过两轮 PCR 扩增，具有更高的灵敏度 四条引物均与模板匹配，因此增加了特异性 可以利用多对引物进行多重 PCR 多重 PCR(multi-primer PCR) 多组引物同时进行的 PCR，可大幅度降低 PCR 反应的工作量 可以在组织切片上进行原位 PCR 原位 PCR(in situ PCR) 在组织切片或细胞涂片上进行的 PCR 方法 主要用于特定基因表达水平的原位分析 组织切片经过固定、蛋白酶和 DNase 消化后进行 RT-PCR 扩增 in situ hybridization 原位杂交：特定 mRNA 的组织细胞分布 FISH Fluorescence in situ hybridization (FISH)：特定基因的染色体定位 反 Northern 杂交与 DNA 芯片 反 Northern 杂交：将探针 DNA 片段固定在杂交膜上，利用标记物标记的 RNA 进行杂交 第二节：聚合酶链式反应 PCR，polymerase chain reaction 在体外选择性扩增特定 DNA 片段的高效手段 70 年代有人提出 PCR 的设想，因缺乏寡核苷酸的合成手段和适合的酶而无法进行 1984 年 Kary Mullis 发明 PCR，并因此获得 1993 年的诺贝尔化学奖 全自动的热循环仪和多种 PCR 衍生技术使其成为重要的科学研究手段 一、PCR 的基本原理 在体外，以特定引物引导，通过 DNA 聚合酶选择性扩增特定区域 变性(denature) 退火(anneal) 延伸(extension) DNA的体内复制 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 解旋酶 解链酶 DNA解旋解链 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ GGAUCG 5’ AUCGCG 5’ 引物酶 引物酶 RNA引物 RNA引物 DNA解旋解链 引物合成 DNA的体内复制 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ GGAUCG 5’ AUCGCG 5’ TAGCGCTATCGCATCGACGCT 3’ ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG 3’ DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 DNA解旋解链 引物合成 新链延伸 DNA的体内复制 ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 5’ 3’ TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG 3’ 5’ 变性 复性 加热 退火 DNA加热解链 模